本文選題：膿毒癥　切入點(diǎn)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的膿毒血癥以其高發(fā)病率、高病死率嚴(yán)重威脅人類健康,成為全球公共衛(wèi)生的挑戰(zhàn)。膿毒癥進(jìn)展中由于臟器缺血、感染等因素導(dǎo)致臟器損傷。當(dāng)多器官功能障礙(MODS)出現(xiàn)時(shí),死亡率驟升至56-100%。既往研究發(fā)現(xiàn),心臟作為MODS時(shí)重要的受損器官之一,大約50%膿毒癥患者可出現(xiàn)心臟功能紊亂,而當(dāng)出現(xiàn)膿毒癥心肌抑制時(shí),病死率可上升至70%。從本質(zhì)上講,膿毒癥是由感染引發(fā)的宿主免疫、炎癥和凝血機(jī)制的失調(diào),其發(fā)病機(jī)制非常的復(fù)雜,這就決定了單一調(diào)控膿毒癥發(fā)病機(jī)制中某一個(gè)環(huán)節(jié)或某一種關(guān)鍵分子的治療措施效果并不理想。因此,膿毒癥心功能障礙的治療需要從整體上改善宿主體內(nèi)紊亂的免疫平衡狀態(tài),才能有效的減輕膿毒癥造成的器官損傷,有效的改善疾病預(yù)后,提高生存率。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多種生物學(xué)效應(yīng),包括調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞活性,抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡,促進(jìn)血管新生,激活體內(nèi)的原位干細(xì)胞等具有多種生物學(xué)效應(yīng)。大量前期研究己發(fā)現(xiàn):間充質(zhì)干細(xì)胞在膿毒癥生物治療方面已嶄露頭角。然而,細(xì)胞治療的作用機(jī)制仍不明確,這就大大限制了治療的獲益及臨床轉(zhuǎn)化。課題針對當(dāng)前膿毒癥細(xì)胞治療機(jī)制不明確的問題,通過建立LPS腹腔注射誘導(dǎo)膿毒癥的小鼠動物模型,在整體水平觀察骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的治療作用,通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型來觀察改變m TORC1-S6k信號通路活性對BMSCs治療膿毒癥療效的影響,通過體外實(shí)驗(yàn)研究m TORC1-S6k信號通路在BMSCs治療膿毒癥過程中的作用機(jī)制,明確膿毒癥生物治療的關(guān)鍵分子靶點(diǎn),以通過機(jī)制干預(yù)來優(yōu)化細(xì)胞治療策略。研究方法:構(gòu)建心肌特異性Raptor敲除及過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠;原代分離、培養(yǎng)、鑒定B6-e GFP-Fluc雙標(biāo)轉(zhuǎn)基因小鼠的BMSCs及成纖維細(xì)胞(Fb),建立LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型,造模成功后分別在腹腔脈注射PBS、Fb或BMSCs,計(jì)算96小時(shí)內(nèi)小鼠生存率,超聲心動圖分別測定造模成功后24、96小時(shí)的左室收縮及舒張功能,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清及心肌組織炎癥因子水平,Xenogen Kinetic 100小動物活體成像系統(tǒng)觀察BMSCs的的歸巢情況,電鏡顯微鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的變化,蘇木精一伊紅(HE)染色法觀察小鼠臟器組織病理變化,免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色觀察小鼠臟器炎性細(xì)胞浸潤,Western Blot免疫印跡試驗(yàn)檢測組織的蛋白水平。體外實(shí)驗(yàn)用Raw264.RAW264.7體外加LPS刺激產(chǎn)生cytomix,分別用來刺激RAPTOR沉默及過表達(dá)的H9c2,并與BMSCs共培養(yǎng),Western Blot檢測H9c2的m TOR,p-m TOR、RAPTOR,rictor、p70S6K、p-Akt,TLR-4、NF-κB、caspase-3的蛋白水平。研究結(jié)果:1.小動物活體成像系統(tǒng)顯示:移植BMSCs后72小時(shí)(POD3),細(xì)胞的熒光強(qiáng)度由第1日POD1(4.02×105±0.36×105)P·s-1·cm-2·sr-1下降至第3日POD3(5.08×104±1.48×104)P·s-1·cm-2·sr-1,提示大量移植BMSCs在炎癥急性期都發(fā)生了急性死亡,且各組間未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。小動物超聲結(jié)果顯示,與PBS組和Fbs組相比,BMSCs治療可顯著提高膿毒癥小鼠的左室收縮及舒張功能,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與野生型BMSCs治療組相比,心肌特異性RAPTOR敲除聯(lián)合BMSCs治療可更大程度的保護(hù)膿毒癥小鼠的心功能(p0.05),而心肌特異性Raptor過表達(dá)聯(lián)合BMSCs治療組,小鼠的心功能較差(p0.05)。log-rank生存曲線分析顯示,與PBS組和Fbs組相比,BMSCs治療可顯著提高膿毒癥小鼠的生存率,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05,p0.05),與野生型BMSCs治療組相比,心肌特異性RAPTOR敲除聯(lián)合BMSCs治療可更大程度的提高膿毒癥小鼠的生存率(p0.05),而心肌特異性RAPTOR過表達(dá)聯(lián)合BMSCs治療則會降低膿毒癥小鼠的生存率(p0.05);2.Elisa檢測顯示,與PBS組和Fbs組相比,BMSCs治療可顯著減輕膿毒癥小鼠的重要臟器及循環(huán)血流中的炎癥因子水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),心肌特異性RAPTOR敲除/過表達(dá)均不能顯著影響心肌組織炎癥因子水平,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.TUNEL染色顯示,與PBS組相比,BMSCs治療可顯著降低膿毒癥小鼠心肌的凋亡指數(shù),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.05),與野生型BMSCs治療組相比,心肌特異性RAPTOR敲除聯(lián)合BMSCs治療可更大程度的降低膿毒癥小鼠的心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)(p0.05),而心肌特異性RAPTOR過表達(dá)聯(lián)合BMSCs治療則會提高膿毒癥小鼠心肌細(xì)胞凋亡率(p0.05)。4.Western blot體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:LPS上調(diào)了心肌細(xì)胞TLR-4以及其下游NF-κB的表達(dá),同時(shí)RAPTOR和p70S6K也被活化,Rictor和Akt出現(xiàn)了下調(diào)。凋亡相關(guān)蛋白caspase-3被上調(diào)(p0.05)。當(dāng)RAPTOR被敲除時(shí),Rictor和Akt蛋白表達(dá)出現(xiàn)上調(diào),TLR-4、NF-κB、Raptor、p70S6K和caspase-3的表達(dá)下調(diào)了(p0.05);當(dāng)RAPTOR敲除聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞治療時(shí),Rictor和Akt出現(xiàn)更為明顯的上調(diào),而TLR-4、NF-κB、Raptor、p70S6K和caspase-3則出現(xiàn)更明顯的下調(diào)。結(jié)論:BMSCs輔助治療能夠提高膿毒癥小鼠生存率,減輕膿毒癥所致重要臟器的病理損傷,改善膿毒癥所致重要臟器的功能,減緩膿毒癥所致心臟功能的下降;降低膿毒癥所致重要臟器炎性細(xì)胞浸潤,降低膿毒癥血清炎癥因子水平,提示BMSCs輔助治療膿毒癥的有效性。證明了Raptor敲除可以增加心肌細(xì)胞的抗炎抗凋亡能力,而BMSCs移植聯(lián)合Raptor敲除可以使心肌細(xì)胞的這種抗炎抗凋亡能力更明顯的增強(qiáng),闡明BMSCs對膿毒癥小鼠治療作用的機(jī)制可能與其抑制巨噬細(xì)胞釋放致炎因子(IL-1、IL-6、TNF-α),活化巨噬細(xì)胞釋放炎癥抑制因子(IL-10),并通過活化心肌細(xì)胞的m TORC2-Akt信號通路增強(qiáng)心肌細(xì)胞存活能力,同時(shí)下調(diào)m TORC1-p70S6K信號通路增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗炎抗凋亡能力有關(guān)。本研究明確了BMSCs治療膿毒癥的有效性和可能存在的分子靶點(diǎn),為解決臨床上膿毒血癥心功能障礙致死率高且無特異性療法這一問題提供了新思路,為優(yōu)化BMSCs作為種子細(xì)胞的療效及安全性提供了研究基礎(chǔ),為實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞治療的臨床轉(zhuǎn)化提供了理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Yi-Xiang J Wang;;Current status of superparamagnetic iron oxide contrast agents for liver magnetic resonance imaging[J];World Journal of Gastroenterology;2015年47期

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本文編號：1584589