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基質(zhì)細(xì)胞衍生因子促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)域定向遷移的研究

發(fā)布時間:2018-02-01 08:23

  本文關(guān)鍵詞: 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs) 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1) 遷移 創(chuàng)傷 出處:《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文 論文類型:學(xué)位論文


【摘要】:研究背景由于腫瘤切除、深度燒傷、放射性治療等導(dǎo)致的組織缺損和各種切口的瘢痕化愈合不僅導(dǎo)致外觀畸形和局部功能障礙,還大大降低了病人生活質(zhì)量,頻繁的住院治療也增加了發(fā)病率和死亡率,導(dǎo)致巨大的社會經(jīng)濟(jì)損耗。近年來人們都在努力尋求微創(chuàng)化或無瘢痕愈合的治療方法。當(dāng)前存在的諸多促修復(fù)方案雖然大大提高了創(chuàng)面愈合能力或者減輕了瘢痕的形成,但是還存在一些局限性,如創(chuàng)面覆蓋物結(jié)合各種細(xì)胞因子的療法價格昂貴且效果有限,組織瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)導(dǎo)致供區(qū)繼發(fā)損傷和瘢痕遺留,假體填充治療引起包膜攣縮等等。因此尋找理想的治療方法促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)以達(dá)到愈合組織的解剖重建和功能恢復(fù)是一直以來迫切需要解決的問題。隨著干細(xì)胞研究技術(shù)令人鼓舞的革命性進(jìn)步,在創(chuàng)傷部位有效補充外源性干細(xì)胞就成為促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的理想策略。干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的細(xì)胞,在特定的培養(yǎng)條件下可以分化成幾種不同類型的細(xì)胞(成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞)。到目前為止,干細(xì)胞已經(jīng)被廣泛地用于治療某些疾病。脂肪來源干細(xì)胞,主要因其取材方便、可反復(fù)獲取,發(fā)展前景巨大,有望成為最常用的干細(xì)胞來源。已有研究證實,脂肪干細(xì)胞移植可有效促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)。2012年,Collawn SS等證實ADSCs可加速創(chuàng)面愈合。隨后,亦有研究表明,脂肪干細(xì)胞移植可促進(jìn)擴張皮膚的再生。公認(rèn)的,干細(xì)胞療法對加強創(chuàng)傷后組織重構(gòu)和功能恢復(fù)具有重要的臨床意義,而干細(xì)胞在體內(nèi)的動員與歸巢是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵。干細(xì)胞歸巢的“歸巢”特性是體內(nèi)干細(xì)胞修復(fù)損傷組織或替代壞死結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。2004年Chen F等認(rèn)為干細(xì)胞首先被動員從其聚集的組織或器官中移出并進(jìn)入外周血,感受到指引其歸巢的趨化因子濃度梯度,然后按信號指引方向遷移到組織損傷部位并粘附到血管內(nèi)皮,黏附到血管內(nèi)皮的干細(xì)胞隨后要穿過血管壁從而進(jìn)入靶組織,定植于新的有利于其增殖和免受程序性細(xì)胞死亡的微環(huán)境中,進(jìn)一步分化成相關(guān)細(xì)胞,從而修復(fù)缺損組織。為了使移植的干細(xì)胞能夠最大化被動員到創(chuàng)傷部位參與修復(fù),我們認(rèn)為首先要選擇有利于干細(xì)胞存活及遷移的移植途徑。目前常用的移植途徑主要為局部移植,然而我們認(rèn)為局部途徑植入的干細(xì)胞雖然更直接且停留創(chuàng)傷部位的細(xì)胞數(shù)量更多,但是相比全身途徑來說,操作較復(fù)雜且細(xì)胞植入起始環(huán)境差,會導(dǎo)致相當(dāng)一部分的細(xì)胞流失,而且細(xì)胞活力會受到很大影響,另外,高密度細(xì)胞團(tuán)在外周組織液中的遷移能力也是有限的。血管內(nèi)注入的全身途徑更有利于干細(xì)胞的存活和遷移,因為血液是細(xì)胞能夠賴以存活的體內(nèi)環(huán)境,不僅提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì),血管內(nèi)壓力差還提供了促使細(xì)胞遷移的動力,但是靜脈移植注入的干細(xì)胞首先要通過肺循環(huán),肺組織存在豐富的毛細(xì)血管網(wǎng),血流緩慢有利于細(xì)胞的貼壁粘附,而且肺組織為干細(xì)胞提供給了更適宜生存的氧分壓環(huán)境,導(dǎo)致循環(huán)中大量的干細(xì)胞被滯留于肺而難以發(fā)揮其有效作用。近年來,有研究表明,動脈移植途徑是進(jìn)行干細(xì)胞移植的一條安全有效的途徑。Makela T等就在其研究中指出靜脈移植干細(xì)胞易導(dǎo)致大量的干細(xì)胞被滯留于肺而難以發(fā)揮其有效作用,而動脈移植有更大的潛能將細(xì)胞輸送至全身血液循環(huán),最終有效到達(dá)細(xì)胞療法的靶器官,然而需要解決的問題是如何更有效地動員并引導(dǎo)循環(huán)中的外源性干細(xì)胞靶向遷移到待修復(fù)組織處。因此,我們想要尋找有效的ADSCs趨化因子;|(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,也常被稱為CXCL12。早期研究者們發(fā)現(xiàn),SDF-1可調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞向創(chuàng)傷微環(huán)境的遷移和歸巢,增強創(chuàng)面邊緣SDF-1的表達(dá)有助于增加內(nèi)皮祖細(xì)胞在創(chuàng)緣的累積,并且加速新生血管化。后來有研究表明,SDF-1也參與調(diào)控了外源性移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及內(nèi)源性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的動員和歸巢。然而相關(guān)的對于脂肪干細(xì)胞(ADSCs)遷移調(diào)控方面的研究尚不成熟。近年來有研究者發(fā)現(xiàn),肝損傷可造成局部肝損傷區(qū)域SDF-1的表達(dá)升高,通過靜脈移植的ADSCs可募集在局部肝損傷區(qū)域,證明通過血管移植的全身途徑是行之有效的干細(xì)胞移植方法,且ADSCs向局部損傷部位的遷移可能與SDF-1的調(diào)控有關(guān)。目的意義本研究的目的在于探究SDF-1對于誘導(dǎo)ADSCs向創(chuàng)傷組織定向趨化遷移的作用,進(jìn)一步驗證通過調(diào)控SDF-1的局部濃度控制ADSCs向創(chuàng)傷組織的趨化遷移是否可行,為充分動員ADSCs發(fā)揮促修復(fù)作用尋找新策略,對于干細(xì)胞療法的廣泛應(yīng)用也具有重要的臨床指導(dǎo)意義。方法1.采用改良的酶消化法分離獲得SD大鼠ADSCs,經(jīng)體外培養(yǎng)、傳代擴增細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征,通過流式細(xì)胞檢測細(xì)胞表面CD29、CD34^ CD45及CD90的表達(dá),體外誘導(dǎo)細(xì)胞成脂成骨分化檢測其多向分化能力。2.構(gòu)建攜帶eGFP基因的慢病毒載體,以經(jīng)驗感染復(fù)數(shù)MOI=40轉(zhuǎn)染第3代ADSCs,并且分別于轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h、96h時,于熒光顯微鏡下觀察ADSCs的綠色熒光蛋白的陽性表達(dá)情況,并于轉(zhuǎn)染一周后,使用流式細(xì)胞檢測ADSCs的eGFP陽性表達(dá)率。繼續(xù)傳代轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞至第九代,于熒光顯微鏡下觀察,驗證隨著細(xì)胞的增殖傳代,eGFP是否可以穩(wěn)定表達(dá)。用MTT法檢測Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染后ADSCs的細(xì)胞活性。對eGFP-ADSCs進(jìn)行成脂成骨誘導(dǎo)分化,以檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞是否仍具備多向分化能力,且驗證分化后的eGFP-ADSCs是否仍可表達(dá)綠色熒光蛋白(eGFP)。3.利用含有SDF-1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基對體外傳代至第3代的ADSCs進(jìn)行培養(yǎng)2天后,流式細(xì)胞技術(shù)及蛋白質(zhì)印跡分析法檢測其細(xì)胞中SDF-1受體CXCR4及CXCR7的表達(dá)情況,并與正常傳代培養(yǎng)的第3代ADSCs進(jìn)行比較。4.構(gòu)建Transwell細(xì)胞遷移模型,檢測體外SDF-1對ADSCs遷移的影響,并且設(shè)置SDF-1的濃度梯度為Oug/L、1ug/L、10ug/L、100ug/L,檢測1-100ug/L濃度范圍內(nèi),ADSCs的遷移與SDF-1濃度有無相關(guān)性。5.構(gòu)建大鼠背部創(chuàng)傷模型,通過動脈移植途徑向動物模型中注入eGFP-ADSCs,設(shè)置空白對照組(未做創(chuàng)傷處理,僅移植eGFP-ADSCs)、創(chuàng)傷組(大鼠背部創(chuàng)傷+eGFP-ADSCs移植)、SDF-1干預(yù)組(大鼠背部創(chuàng)傷+eGFP-ADSCs移植+局部SDF-1給藥)。定期取大鼠背部創(chuàng)傷組織,利用Elisa法檢測創(chuàng)傷組織中SDF-1在創(chuàng)面愈合過程中的表達(dá)趨勢;利用RT-PCR檢測創(chuàng)傷組織中eGFP基因的表達(dá)情況,并在共聚焦顯微鏡下觀察eGFP-ADSCs在創(chuàng)傷組織冰凍切片中的遷移分布情況。定期采集大鼠循環(huán)血,利用流式細(xì)胞計數(shù)及RT-PCR法,對eGFP-ADSCs動員入循環(huán)血的情況加以分析。并于細(xì)胞移植后的21d,分別取三組大鼠血供豐富、氧分壓較高的實質(zhì)性器官——肺組織,進(jìn)行冰凍切片,于共聚焦纖維鏡下觀察eGFP-ADSCs在肺部組織中的分布,利用RT-PCR檢測肺組織中eGFP基因的表達(dá)情況。6.實驗過程中,分別于創(chuàng)傷后1d、3d、7d、14d、21d,觀察記錄兩組創(chuàng)傷大鼠創(chuàng)面愈合的情況,計算創(chuàng)面愈合率;并于創(chuàng)傷后7d采集兩組大鼠創(chuàng)面組織進(jìn)行CD31免疫組化染色,比較兩組創(chuàng)面組織中毛細(xì)血管密度。結(jié)果1.倒置顯微鏡下觀察,分離培養(yǎng)的大鼠ADSCs呈梭型或多角形,流式細(xì)胞技術(shù)檢測ADSCs表面高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD2、CD90;基本不表達(dá)造血及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物標(biāo)記物CD34、CD45。體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后,油紅O染色陽性,證明其具有成脂分化能力;體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28d后,茜素紅染色陽性,證明其具有成骨分化的能力。2. Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染第3代ADSCs,96h時,細(xì)胞的綠色熒光表達(dá)程度達(dá)到高峰,此后維持在較高水平穩(wěn)定表達(dá)。連續(xù)傳代培養(yǎng)至第9代,細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況仍無明顯變化。轉(zhuǎn)染一周后,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染后ADSCs的eGFP陽性表達(dá)率為81.92%(圖2-4),可滿足本實驗的需求。MTT檢測結(jié)果顯示Lentivirus-eGFP轉(zhuǎn)染后的ADSCs與未轉(zhuǎn)染的ADSCs在細(xì)胞活性方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對eGFP-ADSCs進(jìn)行多向分化能力檢測,體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后,油紅O染色陽性,體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)28d后,茜素紅染色陽性,證明慢病毒轉(zhuǎn)染并未對其多向分化能力造成影響。3.流式細(xì)胞結(jié)果顯示,ADSCs在體外培養(yǎng)傳至第3代(P3 ADSCs),其表面SDF-1受體CXCR4、CXCR7的陽性表達(dá)率很低,分別為3.0%、4.1%,經(jīng)SDF-1處理2d后,P3 ADSCs表面CXCR4、CXCR7的陽性表達(dá)率明顯上調(diào)至33.7%、26.4%。Western blot實驗結(jié)果同流式細(xì)胞結(jié)果基本一致,P3 ADSCs中CXCR4與CXCR7表達(dá)水平較低,經(jīng)SDF-1處理后表達(dá)明顯提高。因此說明經(jīng)SDF-1誘導(dǎo)可有效提高傳代后ADSCs表面CXCR4與CXCR7的表達(dá)水平。4. Transwell細(xì)胞遷移實驗中,當(dāng)下室加入SDF-1后,ADSCs細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增加,SDF-1濃度為Oug/L、lug/L、10ug/L、100ug/L時,ADSCs的細(xì)胞遷移率分別為9.77%、13.45%、28.14%、49.14%,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),證明了SDF-1在體外對ADSCs的遷移有誘導(dǎo)作用,且在0-100ug/L的范圍內(nèi),誘導(dǎo)作用呈正相關(guān)關(guān)系,即SDF-1濃度越高ADSCs遷移越明顯。5.Elisa法檢測組織中SDF-1含量顯示,未致創(chuàng)大鼠所取的組織中即正常皮膚組織亦構(gòu)成性地表達(dá)SDF-1,但表達(dá)水平較低,在皮膚致創(chuàng)后即刻至第24h,創(chuàng)傷組織中SDF-1水平呈上調(diào)趨勢,24h時出現(xiàn)SDF-1水平的小高峰,此后在24h-72h間,SDF-1的表達(dá)略有下調(diào),72h-7d間SDF-1水平重又上升,7d時達(dá)到整個愈傷過程的最高峰,隨后SDF-1水平隨創(chuàng)傷的愈合逐漸下降。經(jīng)外源性SDF-1干預(yù)后,創(chuàng)傷組織SDF-1水平在24h-7d間呈穩(wěn)定上升趨勢,未出現(xiàn)明顯波動,7d后直至21d,隨創(chuàng)面愈合,SDF-1水平顯著下降。6.共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞移植后的第1天,eGFP-ADSCs開始少量出現(xiàn)在大鼠創(chuàng)傷組織中,隨著時間的遷移,eGFP-ADSCs細(xì)胞量逐漸增多,并大致分布于表皮組織、腺體及血管周圍。我們利用ImagePro Plus圖像軟件對切片綠熒光強度進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,SDF-1干預(yù)過的創(chuàng)傷大鼠,其創(chuàng)面組織中eGFP-ADSCs的含量在3d、7d、14d及21d均高于未予SDF-1干預(yù)的創(chuàng)傷大鼠。RT-PCR檢測各組創(chuàng)傷組織中eGFP基因的表達(dá)情況,其結(jié)果與冰凍切片的觀察結(jié)果基本吻合。細(xì)胞移植后第21d,對各組大鼠的肺部組織取材進(jìn)行冰凍切片及RT-PCR檢測,結(jié)果顯示,未創(chuàng)傷大鼠肺組織中eGFP-ADSCs含量較另外兩組明顯較多,其中SDF-1干預(yù)的創(chuàng)傷大鼠肺組織中eGFP-ADSCs含量最少。7.流式細(xì)胞分析結(jié)果提示,創(chuàng)傷組大鼠及SDF-1干預(yù)的創(chuàng)傷組大鼠與空白對照組大鼠相比,循環(huán)血中eGFP-ADSCs含量較多;RT-PCR檢測循環(huán)血中eGFP基因表達(dá)情況顯示,各時間點循環(huán)血中eGFP基因的表達(dá)情況:SDF-1干預(yù)的創(chuàng)傷組大鼠創(chuàng)傷組大鼠對照組大鼠。8.移植ADSCs的創(chuàng)傷大鼠在給予外源性SDF-1處理后,其創(chuàng)面愈合速度較未予SDF-1處理的加快,SDF-1處理組的創(chuàng)面愈合率在傷后7d、14d均高于對照組。創(chuàng)傷后7d,取大鼠創(chuàng)面組織進(jìn)行CD31免疫組化染色,結(jié)果顯示,SDF-1處理后的創(chuàng)傷組織中毛細(xì)血管密度明顯高于未予SDF-1處理的創(chuàng)傷組織。結(jié)論1.利用攜帶eGFP基因的慢病毒轉(zhuǎn)染ADSCs獲得eGFP標(biāo)記的ADSCs,可穩(wěn)定表達(dá)eGFP綠色熒光,且不受細(xì)胞傳代增殖分化的影響,轉(zhuǎn)染后ADSCs的生物學(xué)特性亦未受明顯影響,因此可滿足動物體內(nèi)實驗的需求。2.體外培養(yǎng)傳代的ADSCs至P3(第三代)時,其表面SDF-1受體CXCR4及CXCR7的陽性表達(dá)率很低,但在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入SDF-1誘導(dǎo)培養(yǎng)2d后,其表面CXCR4及CXCR7的陽性表達(dá)率可明顯提高。在體外,SDF-1可促進(jìn)ADSCs的跨膜遷移,在0-100ug/L的范圍內(nèi),隨SDF-1濃度的提高,ADSCs的遷移越明顯。3.動物體內(nèi)實驗中,創(chuàng)傷因素可致創(chuàng)傷組織局部SDF-1水平的上調(diào),創(chuàng)傷本身就可動員ADSCs入血并向創(chuàng)傷組織部位遷移,而外源性SDF-1可疊加該作用,增強移植ADSCs的動員與歸巢,減少其向非目的實質(zhì)性器官的遷移。移植ADSCs可參與皮膚創(chuàng)面愈合過程并能促進(jìn)創(chuàng)面的愈合,而SDF-1在募集ADSCs參與創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮著重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號】:R641

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4 申霄;脂肪干細(xì)胞微環(huán)境對衰老成纖維細(xì)胞作用及機制的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

5 吳瓊;基質(zhì)細(xì)胞衍生因子促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)域定向遷移的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

6 肖波;脂肪干細(xì)胞及其來源細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建的新型組織工程神經(jīng)在周圍神經(jīng)修復(fù)中的應(yīng)用[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2016年

7 孫敏;脂肪干細(xì)胞治療小鼠卵巢早衰的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

8 朱艷霞;脂肪干細(xì)胞增殖特性及向心肌細(xì)胞分化的研究[D];大連理工大學(xué);2009年

9 王淼;抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B可促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞分化[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

10 王清富;聚乙烯亞胺介導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 翁劍銳;移植脂肪干細(xì)胞對血管損傷后內(nèi)膜增生的影響及機制研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 劉少鵬;經(jīng)腎動脈移植脂肪干細(xì)胞對大鼠急性缺血性腎損傷的治療作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 張凱哲;Toll樣受體3活化對小鼠脂肪干細(xì)胞生物學(xué)功能的影響[D];大連理工大學(xué);2015年

4 尚志剛;慢病毒介導(dǎo)P63基因轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞的實驗研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2015年

5 依里牙爾·依里哈木;IFN-γ增強脂肪干細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制機制[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2015年

6 李江璇;VEGF基因修飾后人脂肪干細(xì)胞上清對成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的影響[D];暨南大學(xué);2015年

7 祁美武;脂肪干細(xì)胞治療放射性肌肉纖維化的實驗研究[D];南華大學(xué);2015年

8 何赤東;不同方法制備富血小板纖維蛋白對脂肪干細(xì)胞體外增殖影響的實驗研究[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2015年

9 黃成龍;骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞成骨能力的研究[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

10 潘晨晨;糖尿病勃起功能障礙的臨床證型與實驗研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2015年

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