發(fā)布時間：2017-12-04 19:33

  本文關鍵詞：熱損傷后大鼠表皮干細胞中HSP90的表達研究

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【摘要】：目的分離、純化和培養(yǎng)大鼠表皮干細胞(Epidermal stem cells,EpSCs),利用P2~P3代細胞建立熱損傷模型,檢測不同溫度熱損傷后細胞中HSP90的表達變化,探討HSP90對熱損傷后EpSCs轉歸模型的作用。方法剝離SD大鼠皮膚組織,采用“胰蛋白酶兩步消化+Ⅳ型膠原差速貼壁10min”法分離和純化大鼠EpSCs,用K-SFM培養(yǎng)基(keratinocyte serum-free medium)培養(yǎng)細胞。顯微鏡下觀察細胞形態(tài),通過克隆形成實驗和生長曲線,計算細胞克隆形成率,繪制細胞生長曲線,以評價細胞的克隆形成能力和增殖能力。利用免疫熒光技術檢測細胞表面標志物β1-integrin、K19和K10的表達情況,鑒定細胞表型并觀察EpSCs的純度。選擇狀態(tài)良好的2-3代EpSCs作為熱損傷實驗細胞,以37℃作為對照組,分別以41℃、43℃、45℃、48℃、51℃、53℃和55℃作為實驗組的處理溫度,在水浴鍋中孵育10min。利用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)共染,測定熱損傷后EpSCs的凋亡率和存活率;利用RT-PCR及Western Blot實驗方法檢測熱損傷后EpSCs中HSP90基因轉錄及蛋白質表達情況。結果顯微鏡下觀察所培養(yǎng)的細胞體積小、核質比大,細胞膜折光性強,細胞為不規(guī)則多角形,呈集落樣生長,鏡下可見典型的鋪路石狀結構。克隆形成實驗和生長曲線表明,所培養(yǎng)的細胞在體外具有較強的克隆形成能力和增殖能力。細胞免疫熒光技術檢測所培養(yǎng)的細胞表達干性標識β1-integrin和K19,不表達分化標識K10,顯示了所培養(yǎng)的細胞純度較高。Hoechst 33342和PI共染結果顯示:與37℃對照組相比,在41℃~51℃之間,熱損傷后EpSCs的凋亡率和死亡率隨著溫度的升高而遞增,51℃達到細胞凋亡高峰,55℃細胞死亡率最高。RT-PCR及Western Blot實驗檢測結果一致顯示:37℃對照組中HSP90表達量相對偏低;實驗組細胞中HSP90表達變化明顯,在41℃~48℃熱刺激條件下,細胞中HSP90的表達量逐漸增加,其中45℃和48℃組中的表達量大致在同一水平;超過48℃后,HSP90表達水平逐漸下降。結論所培養(yǎng)的細胞符合Ep SCs生物學特征和表型,成功建立了SD大鼠表皮干細胞分離、純化和培養(yǎng)方法;在一定溫度范圍內,熱應激后的EpSCs中HSP90的基因轉錄及蛋白質表達水平上調,HSP90可能參與EpSCs的熱應激反應并發(fā)揮細胞保護作用;48℃下熱損傷細胞10min,為建立EpSCs熱損傷轉歸模型的適宜條件,該模型可用于研究HSP90的細胞保護作用機制。
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R644

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本文編號：1252133