本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細胞在難愈性創(chuàng)面血管生成及愈合中的作用研究

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【摘要】：研究背景和目的 難愈性創(chuàng)面常見于糖尿病、肢端循環(huán)障礙、以及深度創(chuàng)傷等疾病。如何促進這類損傷的愈合一直是創(chuàng)傷領(lǐng)域研究的重要課題。盡管對創(chuàng)傷愈合的病理生理機制已有深刻的認識,在治療措施上也積累了豐富的經(jīng)驗,但目前對難愈創(chuàng)面的治療,仍缺乏十分有效的方法,特別是對糖尿病晚期繼發(fā)性難愈創(chuàng)面患者而言,雖然目前的常規(guī)治療和FDA批準的生長因子等非常規(guī)治療手段也有一定療效,但療效不如預期,對部分患者甚至無效。缺血所導致的機體內(nèi)環(huán)境改變是影響創(chuàng)面修復與愈合的重要機制之一,如何針對機理篩選有效的外源性抗損傷物質(zhì)防治缺血損害是治療的新措施。 已有研究證明MSCs在傷口的愈合中可以分化為其他細胞從而促進創(chuàng)面的愈合,但是MSCs旁分泌的一些可溶性因子可調(diào)控局部細胞反應,在促創(chuàng)面愈合方面這些因子可能發(fā)揮了更重要作用。當組織血管化受損時,MSCs可以通過分泌SDF-1、VEGF、IGF-1、EGF、KGF.血管生成素-1、MIP-1α、EPO、MMP-9等通過刺激EPCs的動員、擴增以及分化從而促進血管新生以及組織再生,因此,MSCs有望在促難愈創(chuàng)面愈合方面產(chǎn)生積極影響。 難愈創(chuàng)面臨床上以糖尿病創(chuàng)面最為常見,本次試驗以糖尿病小鼠模型為基礎(chǔ)建立難愈創(chuàng)面模型,通過創(chuàng)面局部移植BMMSCs的方法,來探討B(tài)MMSCs在難愈創(chuàng)面修復過程中的血管新生以及促愈合的作用。糖尿病作為一種慢性代謝性疾病,長期的高血糖易導致多種并發(fā)癥,因此患者自身BMMSCs的生物學效能也可能受到一定影響。因此在本實驗中,我們也探討了正常小鼠BMMSCs和糖尿病小鼠BMMSCs在體外環(huán)境下生物學效應的差異,并對比兩種來源的BMMSCs對難愈創(chuàng)面的修復差異。 研究內(nèi)容和方法 1、Ⅱ型糖尿病模型的建立 以C57BL/6小鼠和C57BL/6背景的GFP小鼠為實驗用鼠,并長期高脂高糖小鼠飼料喂養(yǎng)。鏈脲佐菌素(STZ)40mg/kg體重,連續(xù)三次腹腔注射,誘導Ⅱ型糖尿病小鼠模型。選取空腹血糖大于等于16.7mmol/L、且持續(xù)兩周的小鼠為Ⅱ型糖尿病動物模型。 2、正常小鼠和糖尿病小鼠GFP-BMMSCs的分離培養(yǎng) 頸部脫臼法處死兩組GFP小鼠并用75%酒精消毒后,在超凈臺中分離出脛骨和股骨,切除骨的兩末端以暴露骨髓腔,用注射器反復沖洗髓腔至髓腔發(fā)白,收集全骨髓細胞,含10%FBS的完全培養(yǎng)液(含雙抗)體外培養(yǎng),通過換液去除非貼壁細胞,細胞融合生長達90%后用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗采用P3代細胞。 3、正常小鼠和糖尿病小鼠GFP-BMMSCs成骨、成脂鑒定 兩組均選取對數(shù)生長期P3代BMMSCs.小鼠成骨誘導液誘導培養(yǎng),每72h換液,誘導20d后,行茜素紅染色了解成骨情況；小鼠成脂誘導體系分A液和B液,先加A液誘導72h,然后換B液維持24h,3個循環(huán)后行油紅O染色了解成脂情況。 4、正常小鼠和糖尿病小鼠GFP-BMMSCs表面抗原檢測 均選取對數(shù)生長期P3代BMMSCs,將細胞懸液分裝到流式管中,200g1/管,含1×106個細胞,分別加入PE熒光標記的Sca-1、CD14、CD29、CD34、CD45、 CD90、CD105抗體,流式細胞儀檢測細胞各標記的熒光值,其中用PE標記的小鼠IgG抗體作為陰性對照。 5、實驗動物分組 選取60只C57BL/6小鼠Ⅱ型糖尿病模型,在每只小鼠左下肢相同部位構(gòu)建直徑6mm圓形創(chuàng)面。第一組創(chuàng)面注射1×106個正常GFP小鼠P3代BMMSCs為正常BMMSCs組,n=20；第二組創(chuàng)面注射1×106個糖尿病GFP小鼠P3代BMMSCs為糖尿病BMMSCs組,n=20；第三組創(chuàng)面注射同劑量PBS為PBS組,n=10;第四組不作任何處理為對照組,n=10。其中正常BMMSCs組和糖尿病BMMSCs組檢測時間點為Od、2d、7d、14d, PBS組和對照組檢測時間點為7d、14d,每個時間點檢測每組樣本n=5。 6、GFP-BMMSCs熒光示蹤 因PBS組和對照組創(chuàng)面未注射BMMSCs,只檢測正常BMMSCs組和糖尿病BMMSCs組創(chuàng)面中的GFP-BMMSCs.每組分別取0d(注射后1h)和2d新鮮創(chuàng)面組織,用OCT包埋后冰凍切片,切片厚度6μm, DAPI熒光標記細胞核,倒置熒光顯微鏡分別在激發(fā)光340nm和509nm通道下觀察并照相。 7、創(chuàng)面VEGF表達水平檢測 檢測時間點為7d和14d。各組創(chuàng)面新鮮組織OCT包埋后冰凍切片,切片厚度6μm,4%多聚甲醛固定10min,0.5%Triton-X-100常溫孵育30min以透化細胞,進口羊血清封閉液封閉60min,加小鼠來源VEGF一抗稀釋液(1：100)4℃過夜,室溫平衡30min后加入Cy3標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)室溫避光孵育2h,DAPI熒光標記細胞核,倒置熒光倒置顯微鏡下觀察并照相,Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件計算平均光密度值(OD)。 8、病理組織學檢查 檢測時間點為7d和14d。創(chuàng)面組織10%福爾馬林固定24h后石蠟包埋,組織常規(guī)石蠟切片,切片厚度5μm,行HE染色,光學顯微鏡下觀察并照相。 9、創(chuàng)面面積 數(shù)碼相機記錄每組0d、7d、14d整體創(chuàng)面愈合情況,Image J軟件測量創(chuàng)面面積,計算7d、14d愈合率。 10、統(tǒng)計學處理 本次試驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩樣本間比較用獨立樣本T檢驗,數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示,P0.05表示有統(tǒng)計學差異。 結(jié)果 1、GFP-BMMSCs分離培養(yǎng)及成骨成脂能力鑒定 正常GFP小鼠BMMSCs接種24h后細胞開始貼壁生長,3d后貼壁細胞增多,接種后7d貼壁細胞明顯增多,大克隆呈圓盤狀,細胞多呈紡錘形或梭形。接種后10-12d大克隆之間逐漸融合,呈輻射狀或漩渦狀排列,并鋪滿整個培養(yǎng)瓶底部。Ⅱ型糖尿病GFP小鼠BMMSCs與正常GFP小鼠BMMSCs相比,3d貼壁細胞較少,細胞生長狀態(tài)較差,接種后10-12d克隆形成較少。 用成骨誘導液誘導培養(yǎng)正常GFP-BMMSCs第18d,細胞結(jié)節(jié)中心的細胞逐漸融合失去細胞結(jié)構(gòu),鈣結(jié)節(jié)形成明顯；誘導20d后進行茜素紅染色,染色呈紅色結(jié)節(jié),顯示成骨分化陽性。說明BMMSCs在成骨誘導液誘導下可以向成骨細胞分化。Ⅱ型糖尿病GFP-BMMSCs在成骨誘導液誘導培養(yǎng)20d后,進行茜素紅染色,染色呈紅色結(jié)節(jié),提示成骨分化陽性,但紅色結(jié)節(jié)較正常GFP少,細胞集落樣生長較小。 用成脂誘導液誘導培養(yǎng)正常GFP-BMMSCs第12d后,細胞形態(tài)變圓,胞漿內(nèi)充溢脂滴。用油紅O染色,脂肪化誘導后細胞內(nèi)充滿大小不一的紅色脂滴,顯示成脂分化陽性。說明BMMSCs在成脂誘導液誘導下分化為脂肪細胞。Ⅱ型糖尿病GFP-BMMSCs在成脂誘導液誘導培養(yǎng)12d后,油紅O染色,胞漿內(nèi)亦有紅色脂滴,但與正常GFP-BMMSCs相比,脂滴大小較小且數(shù)量較少。 2、GFP-BMMSCs表面抗原檢測 流式細胞儀檢測正常GFP小鼠與Ⅱ型糖尿病GFP小鼠BMMSCs特異性分子標記顯示：兩組BMMSCs造血干細胞、淋巴細胞分子標記CD14、CD34、CD45均為陰性,間充質(zhì)干細胞特異分子標記Sca-1、CD29、CD90、CD105均為陽性,分別統(tǒng)計分析兩組陽性率顯示,正常BMMSCs組分別為：94.72±4.82%、96.42±3.79%、97.77±2.86%、94.49±4.85%,糖尿病BMMSCs組分別為：91.72±5.51%、79.14±7.41%、70.59±7.26、92.44±4.90%。獨立樣本T檢驗統(tǒng)計方法分析表明,兩組之間比較Sca-1P=0.386、CD29P=0.002、CD90P=0.000、CD105P=0.524,兩組之間CD29和CD90陽性表達率均有顯著差異。 3、GFP-BMMSCs熒光示蹤 0d(注射后1h)GFP-BMMSCs兩組均較多,正常BMMSCs組為：46.8±8.9個/200倍視野,糖尿病BMMSCs組為：45.8±8.1個/200倍視野,獨立樣本T檢驗顯示,獨立樣本T檢驗統(tǒng)計方法分析表明,P=0.858兩者之間無差異；2d時正常BMMSCs組為：12.2±3.7個/200倍視野,糖尿病BMMSCs組為：5.6±2.6個/200倍視野,獨立樣本T檢驗統(tǒng)計方法分析表明,P=0.012,兩者之間有統(tǒng)計學差異。 4、各組創(chuàng)面VEGF表達水平檢測 熒光顯微鏡下,VEGF呈紅色熒光,7d時對照組和PBS組表達很少,兩者之間無明顯差異,正常BMMSCs組表達較多,糖尿病BMMSCs組表達較正常BMMSCs組少,但多于對照組和PBS組；14d時對照組和PBS組表達較7d有所增加,但主要分布于真皮層下層且分布稀疏,兩者之間無明顯差異,正常BMMSCs組表達分布最廣泛,且已靠近表皮層,糖尿病BMMSCs組較正常BMMSCs組表達稀疏,但多于對照組和PBS組。統(tǒng)計分析各組不同時間平均光密度值(OD),正常BMMSCs組和糖尿病BMMSCs組與PBS組、空白組比較,P0.05；糖尿病BMMSCs組、PBS組和空白組與正常BMMSCs組比較,P均0.05。 5、各組創(chuàng)面病理組織學檢查 HE染色顯示,7d時對照組和PBS組皮膚表面可見較厚的血痂,皮下炎癥浸潤嚴重,可見大量炎癥細胞,膠原纖維形成很少；正常BMMSCs組表皮血痂較少,皮下炎癥環(huán)境改善明顯,炎癥細胞較對照組和PBS組大量減少,膠原纖維形成較多,但糖尿病BMMSCs組炎癥環(huán)境改善和膠原纖維形成均不如正常BMMSCs組明顯。14d時對照組和PBS組仍有血痂存在,創(chuàng)面炎癥浸潤較明顯、炎癥環(huán)境略有改善,有少量膠原纖維形成；正常BMMSCs組已接近痊愈,有粗大并明顯走向的膠原纖維形成,糖尿病BMMSCs組尚有少量炎癥細胞分布,規(guī)則積累的膠原蛋白較少。 6、創(chuàng)面愈合率 數(shù)碼相機拍攝0d、7d、14d創(chuàng)面愈合情況,并用Image J軟件測量其面積,計算出7d和14d創(chuàng)面愈合率。統(tǒng)計分析表明,7d時對照組、PBS組、糖尿病BMMSCs組、正常BMMSCs組愈合率分別為：54.46±6.27%、52.71±5.51%、67.06±6.94%、78.13±7.38%；14d時對照組、PBS組、糖尿病BMMSCs組、正常BMMSCs組愈合率分別為：61.21±6.16%、63.61±7.82%、90.31±2.37%、97.46±2.00%。采用One-Way ANOVA統(tǒng)計學方法進行分析,結(jié)果表明：對照組和PBS組之間無差異；BMMSCs移植組均好于對照組和PBS組,有統(tǒng)計學差異；正常BMMSCs組好于糖尿病BMMSCs組,兩者之間有統(tǒng)計學差異。 結(jié)論 1、與對照組和PBS組相比,BMMSCs促進創(chuàng)面愈合效果明顯； 2、各組創(chuàng)面免疫熒光檢測VEGF的表達發(fā)現(xiàn)：BMMSCs移植組創(chuàng)面、EGF表達有所提高,提示BMMSCs促進創(chuàng)面愈合作用與創(chuàng)面組織血管新生增加有關(guān)； 3、與正常小鼠來源的BMMSCs相比,糖尿病小鼠來源BMMSCs體外活性有所下降,成脂成骨分化能力變差；且糖尿病小鼠來源BMMSCs促創(chuàng)面修復作用降低。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R641

【參考文獻】

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1 裴瑛波;;骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)和定向分化的研究現(xiàn)狀[J];中國組織工程研究與臨床康復;2009年14期

2 田河林;韋立順;許忠新;康艷輝;趙如同;金東嶺;;糖尿病小鼠腎小球微血管密度與VEGF表達的研究[J];中國病理生理雜志;2012年02期

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本文編號：1215197