本文關(guān)鍵詞：Nrf-2信號通路在大鼠膿毒癥急性肺損傷中的保護(hù)機(jī)制

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【摘要】：目的利用盲腸結(jié)扎穿孔法（cecal ligation and puncture,CLP）建立大鼠膿毒癥急性肺損傷（acute lung injury，ALI）模型，以抗氧化相關(guān)因子紅系衍生的核因子相關(guān)因子（Nuclear factor-erythroid2-related factor, Nrf-2）特異性激動劑萊菔硫烷(Sulforaphane，SFN)、抑制劑全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）干預(yù)，測定Nrf-2轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)水平及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase1，HO-1）、過氧化氫酶（catalase，CAT）轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，探索Nrf-2信號通路對大鼠膿毒癥導(dǎo)致急性肺損傷的保護(hù)作用。 方法采用SPF級健康成年雄性Sprage-Dawley大鼠，共128只。隨機(jī)分為假手術(shù)組（SHAM組，32只）、CLP組(32只)、CLP+SFN組(CLP+SFN，CS組32只)和CLP+ATRA組（CLP+ATRA，CA組32只），四組動物按觀察時點8h、16h、24h及生存情況分析組隨機(jī)分成四個亞組(每個亞組各8只)。SHAM組給予腹腔注射0.5ml/100g玉米油，打開腹腔找到盲腸后關(guān)腹；CLP組給予腹腔注射等量玉米油、開腹尋找到盲腸后，以盲腸遠(yuǎn)端頂點為起點，于盲腸全長50%處結(jié)扎盲腸，用20G針頭于腸系膜對側(cè)面所結(jié)扎盲腸的中點、遠(yuǎn)端1/4處扎兩孔，擠出少量腸內(nèi)容物后關(guān)腹；CS組和CA組在CLP建模前30min給予腹腔注射SFN（5mg/kg）、ATRA（1mg/kg）。分別在相應(yīng)時間點以失血性休克法（經(jīng)腹主動脈放血）處死大鼠后取雙側(cè)肺組織，左肺兩葉測量其干濕比值（W/D），右肺下葉部位進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)檢測，中葉組織以Western-Blot法檢測Nrf-2蛋白水平，提取右肺上葉組織中總RNA，用RT-PCR法測Nrf-2，SOD1、HO-1、CAT mRNA水平。 結(jié)果（1）肺組織外觀及病理HE染色：SHAM組動物肺組織外觀正常，支氣管、肺泡、肺泡結(jié)構(gòu)輪廓結(jié)構(gòu)清晰，未見明確病理改變，而CLP組、CS組及CA組動物肺組織外觀及病理改變均較SHAM組出現(xiàn)不同程度損傷，在各時間點CS組動物肺組織損傷程度輕于CLP組，而CA組動物肺組織損傷程度重于CLP組； （2）左肺組織干濕比W/D值：CLP組在建模后三個時間點時肺組織W/D值均較SHAM組升高，其結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）；CS組與SHAM組比較，在16h時肺組織W/D值具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05），與CLP組相比較三個時間點時肺組織W/D值均減低，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01，P0.01，P0.05）；CA組與SHAM組比較，肺組織W/D值在8h、16h時間點有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），CA組與CLP組、CS組比較，肺組織W/D值在8h、16h時間點具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.01）； （3）免疫組織化學(xué)（IHC-P）半定量分析Nrf-2：SHAM組Nrf-2表達(dá)較少，少部分支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)，為弱陽性表達(dá)，多為細(xì)胞質(zhì)染色；CLP組Nrf-2表達(dá)強(qiáng)于SHAM組，多見于支氣管上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞，為中~強(qiáng)陽性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均有表達(dá)。CS組Nrf-2表達(dá)強(qiáng)于SHAM組及CLP組，支氣管上皮細(xì)胞、炎癥浸潤細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞均有表達(dá)，其中肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)，多為細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，為強(qiáng)陽性表達(dá)。CA組Nrf-2表達(dá)情況較少，部分支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)，為弱陽性表達(dá)，多為細(xì)胞質(zhì)染色，偶見細(xì)胞核染色。 肺組織Nrf-2陽性系數(shù)結(jié)果如下：CLP組8h、16h及24h時間點時Nrf-2陽性系數(shù)均較SHAM組高，其結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05，P＜0.01，P＜0.01）。CS組在8h、16h及24h時Nrf-2陽性系數(shù)較SHAM組明顯升高，其結(jié)果具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01，P0.01，P0.01）；CS組與CLP組相比較，8h、16h及24h三個時間點時Nrf-2陽性系數(shù)均升高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01，P0.05，P0.01）。CA組Nrf-2陽性系數(shù)在8h、16h及24h時間點較SHAM組升高，其結(jié)果均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）；CA組Nrf-2陽性系數(shù)在8h、16h及24h時間點較CLP組、CS組下降，其結(jié)果均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。 （4）Nrf-2、SOD1、CAT、HO-1mRNA表達(dá)： 肺組織中Nrf-2mRNA表達(dá)情況：CLP組Nrf-2mRNA表達(dá)在8h、16h較SHAM組升高，而在24h時較SHAM組下降，其結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05，P0.01，P0.01）；CS組Nrf-2mRNA表達(dá)在8h、16h及24h時較SHAM組、CLP組明顯升高，其結(jié)果均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異及統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01；P0.05，P0.01，P0.01）；CA組Nrf-2mRNA表達(dá)在16h及24h時與SHAM組具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）；CA組Nrf-2mRNA表達(dá)在8h時較CLP組下降，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；CA組Nrf-2mRNA表達(dá)在8h、16h及24h各時間點均較CS組明顯下降，其結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。 肺組織中SOD1mRNA表達(dá)情況：CLP組SOD1mRNA表達(dá)在8h、16h較SHAM組升高，而在24h時較SHAM組下降，其結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05，P0.01，P0.01）；CS組SOD1mRNA表達(dá)在8h、16h及24h時均較SHAM組、CLP組明顯升高，其結(jié)果均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異及統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01；P0.05，P0.01，P0.01）；CA組SOD1mRNA表達(dá)在16h及24h時與SHAM組均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；CA組SOD1mRNA表達(dá)在8h時較CLP組下降，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；CA組SOD1mRNA表達(dá)在8h、16h及24h各時間點均較CS組明顯下降，其結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。 肺組織中CAT mRNA表達(dá)情況：CLP組CAT mRNA表達(dá)在8h、16h較SHAM組升高，而在24h時較SHAM組下降，其結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05，P0.01，P0.01）；CS組CAT mRNA表達(dá)在8h、16h及24h各時間點均較SHAM組、CLP組明顯升高，其結(jié)果均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異及統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01；P0.05，P0.01，P0.01）；CA組CAT mRNA表達(dá)在8h、16h及24h時與SHAM組不具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；CA組CAT mRNA表達(dá)在8h時較CLP組下降，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；CA組CAT mRNA表達(dá)在8h、16h及24h各時間點均較CS組明顯下降，，其結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。 肺組織中HO-1mRNA表達(dá)情況：CLP組HO-1mRNA表達(dá)在8h、16h較SHAM組升高，而在24h時較SHAM組下降，其結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05，P0.05，P0.05）；CS組HO-1mRNA表達(dá)在8h、16h及24h各時間點均較SHAM組、CLP組明顯升高，其結(jié)果均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異及統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01；P0.05，P0.01，P0.01）；CA組HO-1mRNA表達(dá)在8h、16h時與SHAM組比較升高，其結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）；CA組、CLP組HO-1mRNA表達(dá)在8h、16h及24h時結(jié)果均不具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；CA組HO-1mRNA表達(dá)在8h、16h及24h各時間點均較CS組明顯下降，其結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05，P0.05，P0.01）。 （5）肺組織中Nrf-2蛋白含量測定：CLP組8h、16h時Nrf-2蛋白含量均較SHAM組升高，而在24h時間點時Nrf-2蛋白含量較SHAM組下降，其結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。CS組在8h、16h及24h時Nrf-2蛋白含量較SHAM組明顯升高，其結(jié)果具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異或統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01，P0.01，P0.05）；與CLP組相比較8h、16h及24h三個時間點時肺組織Nrf-2蛋白含量均升高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05，P0.01，P0.01）。CA組Nrf-2蛋白含量在24h時間點較SHAM組下降，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05），而在8h、16h時間點沒有統(tǒng)計學(xué)差異；CA組Nrf-2蛋白含量在8h、16h時間點較CLP組下降，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05），而在24h時間點沒有統(tǒng)計學(xué)差異；CA組Nrf-2蛋白含量在8h、16h及24h點時均明顯下降，其結(jié)果具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。 結(jié)論Nrf-2激活可調(diào)控體內(nèi)ARE依賴的抗氧化基因SOD、CAT、HO-1表達(dá)，發(fā)揮抗氧化效應(yīng)，對大鼠膿毒癥急性肺損傷具有保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 Melinda Sue YATES;Thomas Wells KENSLER;;Keap1 eye on the target:chemoprevention of liver cancer[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年09期

本文編號：1170016