本文關(guān)鍵詞：miR-494對脂多糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

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【摘要】：目的:觀察mi R-494在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中的表達(dá)變化,并進(jìn)一步探討mi R-494對HK-2細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法:1、體外培養(yǎng)HK-2,給予1 ug/ml LPS分別干預(yù)0 h、1 h、3 h、6 h、12 h。采用Real-time PCR檢測mi R-494的表達(dá)變化。2、構(gòu)建mi R-494慢病毒過表達(dá)及陰性對照載體,轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞,熒光顯微鏡下估算轉(zhuǎn)染效率。3、將HK-2分為四組:control組、LPS刺激組、mi R-494過表達(dá)+LPS組、mi R-494陰性轉(zhuǎn)染+LPS組,除control組外,各組細(xì)胞予以相應(yīng)處理后再均以1ug/ml LPS干預(yù)6 h。用Real-time PCR檢測各組mi R-494、ATF3的表達(dá)水平。Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞法分別檢測各組細(xì)胞的凋亡率。采用ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α的濃度。結(jié)果:1、LPS刺激1 h后,HK-2細(xì)胞中mi R-494的表達(dá)水平即達(dá)到頂峰,為0 h組的3.19±0.21倍(P0.05),3 h、6 h和12 h的表達(dá)量逐漸下降,與0 h組的mi R-494表達(dá)量均有統(tǒng)計學(xué)意義。2、LV-mi R-494慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察Zs Green綠色熒光,細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%以上,q PCR檢測LV-mi R-494+LPS組細(xì)胞mi R-494較control組的表達(dá)水平為8.57±0.50倍(P0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示轉(zhuǎn)染成功。3、與control相比,LV-mi R-494+LPS組、LV+LPS組及LPS組的mi R-494表達(dá)水平分別為(8.57±0.50 vs 2.47±0.04 vs 2.34±0.02);ATF3 m RNA表達(dá)水平為(2.12±0.37 vs 5.84±0.42 vs 5.45±0.53),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)4、流式細(xì)胞檢測各組HK-2細(xì)胞凋亡水平:與control組比較,LPS組、LV-mi R-494+LPS組及LV+LPS組的細(xì)胞凋亡率明顯高于control組(P0.05),LV+LPS組與LPS組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5、ELISA法檢測各組細(xì)胞IL-6、TNF-α的濃度:在LPS刺激下LV-mi R-494+LPS組、LV+LPS組、LPS組IL-6、TNF-α蛋白水平較control組均顯著提高,且LV-mi R-494+LPS組與其它兩組相比,IL-6、TNF-α蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),表明mi R-494的過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α有促進(jìn)作用。結(jié)論:1、LPS可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡。2、重組慢病毒轉(zhuǎn)染HK-2后,mi R-494表達(dá)明顯上調(diào),其靶基因ATF3表達(dá)下調(diào)。3、過表達(dá)mi R-494可顯著促進(jìn)炎性因子的釋放,增強(qiáng)LPS的促凋亡作用,此作用機(jī)制可能是通過靶向抑制ATF3基因?qū)崿F(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：微小RNA-494 膿毒癥 急性腎損傷 凋亡 慢病毒
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 前言10-13
• 第2章 材料與方法13-23
• 2.1 實驗材料13-14
• 2.1.1 實驗細(xì)胞13
• 2.1.2 慢病毒載體構(gòu)建13
• 2.1.3 實驗儀器及設(shè)備13
• 2.1.4 主要試劑13-14
• 2.2 器材準(zhǔn)備及主要溶液配置14-16
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)器皿的滅菌處理14
• 2.2.2 去m RNA酶處理14
• 2.2.3 主要溶液配置14-16
• 2.3 實驗方法16-22
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)16-17
• 2.3.2 miR-494慢病毒及陰性對照慢病毒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染17
• 2.3.3 實驗分組17-18
• 2.3.4 miR-494慢病毒感染HK-2 細(xì)胞18
• 2.3.5 qRT-PCR檢測各組HK-2 細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)18-21
• 2.3.6 ELISA法檢測各實驗組HK-2 細(xì)胞上清液IL-6、TNF-α 蛋白的表達(dá)21-22
• 2.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況22
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)方法22-23
• 第3章 結(jié)果23-30
• 3.1 HK-2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果23
• 3.2 慢病毒轉(zhuǎn)染HK-2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果23-24
• 3.3 Real-time PCR檢測結(jié)果24-27
• 3.3.1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳24
• 3.3.2 miR-494在LPS誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞中的動態(tài)表達(dá)變化24-25
• 3.3.3 慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-494、ATF3 m RNA的表達(dá)水平25-27
• 3.4 ELISA檢測各組HK-2 細(xì)胞中IL-6、TNF-α 蛋白的表達(dá)水平27-28
• 3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HK-2 細(xì)胞凋亡率28-30
• 第4章 討論30-35
• 4.1 體外模型的建立30-31
• 4.2 LPS誘導(dǎo)后HK-2 的miR-494的差異性表達(dá)31-33
• 4.3 過表達(dá)miR-494調(diào)控LPS誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞凋亡33-35
• 第5章 結(jié)論與展望35-36
• 5.1 結(jié)論35
• 5.2 不足與展望35-36
• 致謝36-37
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 綜述40-48
• 參考文獻(xiàn)46-48

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 趙俊麗;王儉勤;王晶宇;;LPS通過TLR4信號通路誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)表達(dá)hBD-2[J];免疫學(xué)雜志;2013年03期

2 須靜;胡曉波;;中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的研究進(jìn)展[J];檢驗醫(yī)學(xué);2012年10期

3 朱曉霞;李學(xué)農(nóng);郭煜;;慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾對鼻咽癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1的沉默效應(yīng)[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2010年07期

4 杜志明;江柏青;;ATF3與腫瘤的研究進(jìn)展[J];贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2010年01期

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本文編號：1129074