本文關鍵詞：基于抗原組學技術篩選與鑒定尖吻蝮蛇蛇毒保護性抗原

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【摘要】：蛇類在地球上有著廣泛的分布，目前已被發(fā)現的蛇類多達3000多種，其中只有15%的蛇類是具有毒性的，對人類健康造成威脅。毒蛇咬傷主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶農村地區(qū)，特別是低收入國家農村地區(qū)，因此許多毒蛇咬傷病例未予報告，造成流行病學資料缺失，蛇傷的具體發(fā)病情況難以得到正確統(tǒng)計。據報道，全球每年大約有2500000蛇咬傷病例發(fā)生，大約有125000人因毒蛇咬傷死亡。在2009年，世界衛(wèi)生組織（WHO）首次承認，蛇咬傷是一個被長期忽視的公眾健康問題。 尖吻蝮蛇是我國特有的蛇種，主要分布在中國南方地區(qū)，其分泌的毒液中含有多種毒素成分，目前研究較多的毒素成分是金屬蛋白酶（Metalloproteinase）、磷酯酶A2（PhospholipaseA2）、絲氨酸蛋白酶（Serine proteases）、C型凝集素（C-type lectin-likeprotein）。尖吻蝮蛇蛇毒具有很強的血液毒性，中毒后常造成全身系統(tǒng)性的出血，局部組織壞死，給臨床治療帶來困難。 噬菌體展示肽庫技術是近幾年來發(fā)展起來的，用于模擬抗原研究的新技術，這一技術現已成功的運用于模擬抗原篩選，并能誘導動物產生免疫應答，其基本原理是：在噬菌體表面插入各種組合的氨基酸短肽，通過抗原抗體識別反應，使含有特定蛋白的噬菌體，從肽庫中篩選出來，通過測序獲得特定蛋白的結構和功能信息�，F這一技術在確定抗原表位、篩選小分子模擬肽、疫苗開發(fā)、分子診斷等領域得到了廣泛應用。 研究目的：利用尖吻蝮蛇蛇毒免疫新西蘭兔，通過實驗純化制備特異性尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體，并通過動物實驗檢測多克隆抗體的生物活性；在純化尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體的基礎上，利用噬菌體展示肽庫技術，篩選與鑒定尖吻蝮蛇蛇毒保護性抗原，并采用基因工程技術，合成、表達重組抗原肽，對重組抗原肽免疫保護效應進行評估,從而為新型抗蛇毒血清的研究奠定基礎。 研究內容和方法： 第一部分：以尖吻蝮蛇蛇毒免疫新西蘭兔，并利用Econo-Pac ProteinAkit及CNBractivated sepharose4B凝膠對兔源性抗蛇毒抗體進行純化，制備特異性尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體，，用Western blot和ELISA對抗體進行評價，通過出血抑制實驗及致死性保護實驗評價抗體的生物活性。 第二部分：以抗尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體為靶蛋白，對噬菌體隨機肽庫進行三輪生物淘選，獲得與抗體特異性結合噬菌體陽性克隆，通過ELISA法和Western blot測定噬菌體單克隆與抗體的結合力，進一步篩選陽性克隆，對候選陽性克隆進行測序，得到插入短肽氨基酸序列，利用基因工程技術，對篩選獲得的抗原片斷進行串聯(lián)重組表達，獲得重組抗原肽，將重組抗原肽免疫BALB/C小鼠，并通過出血抑制實驗，評估重組抗原肽的免疫保護效果。 主要實驗結果： 1）成功地制備了抗尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體，通過ELISA法檢測，抗蛇毒抗體滴度＞1:3200；Western blot分析示：多克隆抗體與蛇毒中大多數毒素蛋白結合；體外出血抑制試驗顯示該抗體能有效地抑制尖吻蝮蛇蛇毒所導致的皮內出血；在致死性保護實驗中，多克隆抗體對2LD50和4LD50蛇毒分別起到100%和54%的保護作用。 2）在本研究中，利用噬菌體展示肽庫技術篩選出5個抗原表位，將該部分抗原進行串聯(lián)重組表達，獲得重組抗原肽，通過ELISA實驗證明，重組抗原肽能有效的刺激小鼠產生抗體，該抗體能與重組抗原肽結合，也能被蛇毒抗原識別，與重組抗原肽識別滴度達到1:64000，與蛇毒識別滴度達到1:8000。在體外出血中和試驗中，重組抗原肽免疫小鼠血清能100%抑制2MHD尖吻蝮蛇蛇毒所致的皮內出血，能減少82%的由4MHD蛇毒所致的皮內出血面積。 結論本研究通過噬菌體展示肽技術，篩選與鑒定出5個抗原表位，這些抗原表位具有較好的免疫保護性，從而為新型抗蛇毒血清的研究與開發(fā)奠定了基礎。
【關鍵詞】：尖吻蝮蛇 多克隆抗體 噬菌體肽庫 抗蛇毒血清
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R646
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-9
• 摘要9-11
• 第一章 前言11-16
• 第二章 尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體純化及生物活性研究16-34
• 2.1 實驗材料與試劑16-18
• 2.2 實驗方法18-27
• 2.3 實驗結果27-31
• 2.4 討論31-34
• 第三章 隨機肽庫技術篩選與鑒定尖吻蝮蛇保護性抗原34-53
• 3.1 實驗材料與試劑34-36
• 3.2 實驗方法36-43
• 3.3 實驗結果43-50
• 3.4 討論50-53
• 全文總結53-54
• 參考文獻54-58
• 附件58-66
• 文獻綜述66-79
• 參考文獻74-79
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章目錄79-80
• 致謝80

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前3條

1 周亞麗;勞興珍;袁玲;柳萌;鄭珩;;免疫球蛋白結合結構域的研究進展[J];藥物生物技術;2012年03期

2 黃春洪;孔毅;吳杰連;劉睿;吳梧桐;;尖吻蝮蛇毒素組雙向電泳和二維液相色譜研究[J];中國藥科大學學報;2006年02期

3 牛立文;滕脈坤;朱中良;高永翔;張平;;若干蛇毒蛋白的結構生物學研究[J];中國科學技術大學學報;2008年08期

本文編號：1095766