本文關(guān)鍵詞：原花青素對組蛋白誘導淋巴細胞凋亡的作用及機制

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【摘要】：研究背景膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應綜合征。膿毒癥病死率高,是危重癥監(jiān)護病房內(nèi)最常見的死亡原因之一,并且發(fā)病率逐年升高。膿毒癥時免疫細胞凋亡及其后續(xù)的免疫抑制是導致膿毒癥患者死亡的重要原因。其中,淋巴細胞在機體的免疫保護中發(fā)揮了重要的作用。已有大量研究顯示：膿毒癥時可出現(xiàn)免疫器官及外周血中大量淋巴細胞凋亡,這些細胞的凋亡又可繼發(fā)嚴重的免疫抑制。新的研究顯示,細胞外組蛋白在膿毒癥發(fā)病及致死過程中發(fā)揮了重要作用,被認為是膿毒癥治療的一個潛在靶點。我們的前期研究顯示,膿毒癥過程中大量釋放的細胞外組蛋白可通過線粒體損傷介導淋巴細胞凋亡。葡萄籽原花青素(GSPE)是從葡萄籽中提取的原花青素,含有大量的酚羥基�？寡趸亩喾宇惢衔镉幸粋�非常重要的功能,它們可以清除氧自由基,并減少膜脂質(zhì)體過氧化作用。研究顯示原花青素具有廣泛的生物學效應,如抗氧化性、抗炎及線粒體保護作用,而線粒體損傷是組蛋白介導淋巴細胞損傷的重要途徑,因此我們推斷原花青素可能具有抑制組蛋白介導的淋巴細胞凋亡作用,并通過該研究明確GSPE對組蛋白介導淋巴細胞凋亡的作用及機制。研究目的1.明確原花青素是否可以抑制組蛋白誘導的淋巴細胞凋亡；2.探討原花青素是否通過清除氧自由基,p38通路和線粒體途徑保護保護組蛋白誘導的淋巴細胞凋亡。研究方法1.分離人血淋巴細胞經(jīng)靜脈抽取健康志愿者外周血20mL,肝素抗凝,與PBS等比例稀釋混勻后平均分為5管,分別緩慢加入裝有5m1淋巴細胞分離液的離心管上部,設(shè)置溫度20℃,離心機2000rpm離心30min,吸取中間富淋巴細胞的白膜層,經(jīng)PBS洗滌1遍離心后,用不含血清的1640培養(yǎng)基重懸全部淋巴細胞至同一個EP管中,并計數(shù)備用。2.藥物處理淋巴細胞來源于健康志愿者全血,經(jīng)淋巴細胞分離后,培養(yǎng)于1640培養(yǎng)液中。淋巴細胞分為4個組,培養(yǎng)于6孔板中,密度為1×106個/孔。Ⅰ空白對照組；Ⅱ組蛋白處理組(50μg/ml);處理組(2μg/ml); IVGSPE+組蛋白處理組。Ⅲ和Ⅳ組先分別予GSPE處理2小時,Ⅱ與Ⅳ組再與組蛋白50ug/mL處理2.5h。3.細胞分析a)細胞活力測試細胞生存能力用CCK8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]測定。將淋巴細胞按密度為1.25×105細胞/孔接種在96孔板,每孔100μ1。經(jīng)藥物處理后,采用CCK8法檢測細胞活力。b)人外周血淋巴細胞凋亡的檢測將處理好的人外周血淋巴細胞1000rpm離心10min,棄上清,加入1mLPBS,洗滌重懸,離心,棄去上清,AnnexinV-FITC/PI避光孵育15min, PBS重懸細胞后用流式細胞儀檢測每管淋巴細胞的凋亡率。c)線粒體內(nèi)膜損傷檢測將處理好的人外周血淋巴細胞離心棄去上清,加入羅丹明123(Rhodamine123)染色劑至終濃度1μM,在37℃避光染色30min, PBS洗滌2遍并重懸細胞后,流式細胞儀檢測線粒體膜電位。d)活性氧(ROS)生成量檢測將處理好的淋巴細胞離心棄去上清,加入DCFH-DA染色劑至終濃度1umol/ml,于37℃避光孵育30min, PBS洗滌2遍并重懸細胞后,流式細胞儀檢測ROS生成量。4. Western Blot法測定淋巴細胞中相關(guān)蛋白的表達a)線粒體膜蛋白Bcl-2的檢測將處理好的細胞1200rpm離心10min,經(jīng)PBS洗滌后棄去上清,加入細胞裂解液(RIPA)于冰上裂解30min,提取總蛋白,14000rpm離心后取上清,變性后存儲于-20℃。以GAPDH為內(nèi)參蛋白調(diào)整所有蛋白樣品至等濃度后上樣,western blot免疫蛋白印跡法檢測各組Bcl-2蛋白的表達量。b)細胞信號通路p38MAPK磷酸化檢測將處理好的細胞1200rpm離心10min,經(jīng)PBS洗滌后棄去上清,加入細胞裂解液(RIPA)于冰上裂解30min,提取總蛋白,14000rpm離心后取上清,變性后存儲于-20℃。以GAPDH為內(nèi)參蛋白調(diào)整所有蛋白樣品至等濃度后上樣,western blot免疫蛋白印跡法檢測各組p38MAPK磷酸化的表達量。c)凋亡蛋白Caspase3活化檢測將處理好的細胞1200rpm離心10min,經(jīng)PBS洗滌后棄去上清,加入細胞裂解液(RIPA)于冰上裂解30min,提取總蛋白,14000rpm離心后取上清,變性后存儲于-20℃。以GAPDH為內(nèi)參蛋白調(diào)整所有蛋白樣品至等濃度后上樣,western blot免疫蛋白印跡法檢測各組凋亡蛋白Caspase3活化的表達量。5.統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標準差(X±s)表示,采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。單因素方差分析(one-way ANOVA)用于各組間均數(shù)差異顯著性的比較,2-tailedStudent'st檢驗用于組間兩兩比較,P值小于0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果1.GSPE對淋巴細胞活力的影響GSPE對淋巴細胞活力沒有明顯的改變,差異沒有統(tǒng)計學意義。與對照組比較,組蛋白組在濃度達到50μg/ml時淋巴細胞活力明顯下降(P0.05)。2.GSPE對組蛋白誘導的淋巴細胞凋亡的影響將GSPE預處理淋巴細胞2h后,再與組蛋白刺激2.5h。細胞凋亡率分析使用AnnexinV-FITC/PI染色和流式細胞分析儀。組蛋白組顯示凋亡細胞的比例非常高,相比對照組(16.58±7.17% vs 3.15±1.06%,P0.01)。組蛋白+GSPE組與組蛋白組比較,淋巴細胞凋亡率顯著降低(7.03±1.93% vs 16.58±7.17%,P0.01)。GSPE組淋巴細胞凋亡率為(2.74±1.98%)。3.GSPE降低組蛋白誘導的淋巴細胞內(nèi)ROS的生成量組蛋白組和對照組相比,ROS強度顯著增加,(2671.94±752.07 vs 1432.42±434.26,P0.01)。組蛋白+GSPE組與組蛋白組比較,ROS生成量顯著減少(2101.13±773.22 vs 2671.94±752.07, P0.01)。GEPE組與對照組相比,ROS生成量沒有明顯降低(1274.97±434.25 vs 1432.42±434.26, P0.05)。4.GSPE保護組蛋白介導的線粒體損傷與正常對照相比,組蛋白組的線粒體膜電位顯著降低,(49.19±3.36 vs68.85±4.07,P0.01),表明其線粒體損傷嚴重。組蛋白+GSPE組與組蛋白組比較,線粒體膜電位顯著增加(66.83±3.3 vs 49.19±3.36, P0.01)。GEPE組與對照組比較,線粒體膜電位沒有明顯下降(70.88±4.37 vs 68.85±4.07,P0.05)。5.GSPE拮抗組蛋白引起的Bcl-2下調(diào)和caspase3活化Western blot結(jié)果顯示組蛋白組B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族蛋白的表達量下降,但GSPE治療組的Bcl-2的表達量相比組蛋白組明顯上升,(P0.05)。此外,GSPE預處理能中和組蛋白導致的Bcl-2下調(diào)(P0.05)。組蛋白組活化的caspase3表達量較其他組顯著增多,GSPE預處理可以降低組蛋白誘導的caspase3活化(P0.05)。6.GSPE抑制組蛋白引起的p38磷酸化Western blot結(jié)果顯示組蛋白磷酸化的p38表達量較對照組顯著增多(P0.05)。其次,GSPE預處理組的磷酸化的p38表達量較組蛋白組顯著降低(P0.05)。實驗結(jié)論1.GSPE對細胞外組蛋白引起的人血淋巴細胞凋亡發(fā)揮了重要保護作用。2.GSPE可能通過抑制ROS產(chǎn)生、MAPK p38磷酸化、線粒體損傷及caspase3活化抑制組蛋白介導的淋巴細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：GSPE 組蛋白 淋巴細胞凋亡 ROS線粒體
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-19
• 第一章 GSPE和組蛋白的淋巴細胞毒性19-29
• 1.1 研究目的19
• 1.2 材料與方法19-24
• 1.3 結(jié)果24-27
• 1.4 討論27-29
• 第二章 GSPE和組蛋白對淋巴細胞凋亡作用的研究29-35
• 2.1 研究目的29
• 2.2 材料和方法29-32
• 2.3 結(jié)果32-33
• 2.4 討論33-35
• 第三章 GSPE作用于組蛋白誘導的淋巴細胞凋亡的機制35-45
• 3.1 實驗目的35
• 3.2 材料和方法35-38
• 3.3 結(jié)果38-41
• 3.4 討論41-45
• 第四章 GSPE對淋巴細胞中Bcl-2、p38、caspase3蛋白表達的影響45-59
• 4.1 研究目的45
• 4.2 材料和方法45-52
• 4.3 結(jié)果52-55
• 4.4 討論55-59
• 全文小結(jié)59-62
• 參考文獻62-67
• 中英文對照與縮略詞表67-68
• 學習期間發(fā)表論文68-69
• 致謝69-70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李浩;石勝良;吳嵐;畢桂南;;原花青素對大鼠腦缺血再灌注損傷Caspase-3和Caspase-9活性的影響[J];時珍國醫(yī)國藥;2010年02期

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本文編號：1041827