本文選題：生殖器形成抑制基因-1　切入點(diǎn)：凋亡　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：卵巢癌是常見(jiàn)的一種婦科惡性腫瘤,有著很高的死亡率,目前對(duì)該病的治療主要是手術(shù)加化療,而化療耐藥使得該病治療效果并不樂(lè)觀。如今針對(duì)卵巢癌的研究雖然已經(jīng)有了很大的發(fā)展,但卵巢癌具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,這給卵巢癌的防治工作帶來(lái)了極大的困難。作為一種實(shí)體性腫瘤,卵巢癌內(nèi)部存在著一定程度的缺氧,缺氧微環(huán)境對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響,這種影響在腫瘤細(xì)胞的凋亡、侵襲、遷移等一系列生物學(xué)行為上都已有研究。因此以缺氧的卵巢癌細(xì)胞為研究對(duì)象對(duì)卵巢癌相關(guān)生物學(xué)行為進(jìn)行研究更能貼近腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)情況,具有不可忽視的重要意義。生殖器形成抑制基因-1(suppressor of morphogenesis in genitalia-1,SMG-1)是在無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途徑中被廣泛研究的重要調(diào)節(jié)因子,該途徑可降解包含過(guò)早終止密碼子的mRNA來(lái)防止具有潛在毒性的截短蛋白的產(chǎn)生。SMG-1同時(shí)也是磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase,PIKK)家族成員之一,同其他PIKK蛋白激酶一樣,SMG-1在DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用,從而維持基因組的穩(wěn)定性。除此之外SMG-1還參與到氧化應(yīng)激反應(yīng)、缺氧、細(xì)胞增殖及凋亡等多個(gè)生物進(jìn)程中,甚至可以調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng),目前已有多項(xiàng)研究將其引入腫瘤領(lǐng)域。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在很多人類腫瘤中可被持續(xù)性激活,形成p-STAT3,p-STAT3可形成二聚體,從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,從而對(duì)一系列的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,發(fā)揮生物學(xué)功能。STAT3是許多致癌相關(guān)信號(hào)通路的匯聚點(diǎn),可控制若干促炎性細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在人卵巢癌細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)異常激活的STAT3,該異�；罨癄顟B(tài)的STAT3可對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖及凋亡產(chǎn)生影響。目的本研究采用qRT-PCR、Western blot的方法檢測(cè)缺氧狀態(tài)下的卵巢癌細(xì)胞中SMG-1的表達(dá)情況及抑制該基因后STAT3的表達(dá)及活化情況,用流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8檢測(cè)抑制SMG-1基因后對(duì)缺氧卵巢癌細(xì)胞凋亡、增殖情況的影響,來(lái)探究缺氧條件下SMG-1的表達(dá)以及沉默SMG-1基因?qū)θ毖鯛顟B(tài)卵巢癌細(xì)胞凋亡和STAT3、p-STAT3表達(dá)的影響。材料和方法1研究對(duì)象本研究選用人卵巢癌SKOV3細(xì)胞系(購(gòu)自American Type Culture Collection),在37℃、5%CO_2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中,用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)進(jìn)行培養(yǎng)。2方法本研究使用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞,待細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)開(kāi)始種板進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。2.1缺氧實(shí)驗(yàn)分組及處理將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后以1.0×105密度接種于六孔板中,細(xì)胞長(zhǎng)滿50%-60%時(shí)開(kāi)始缺氧處理。細(xì)胞分為常氧組和缺氧組。缺氧組加入氯化鈷(終濃度150μmol/L),常氧組不作處理。48h后分別提取總mRNA和總蛋白,首先通過(guò)Western blot方法對(duì)缺氧效果進(jìn)行驗(yàn)證,缺氧后HIF-1α蛋白表達(dá)量與未缺氧組細(xì)胞相比明顯升高(P0.05)為缺氧成功。然后采用qRT-PCR和Western blot方法對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行SMG-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。2.2轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組及處理將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后以1.0×105密度接種于六孔板中,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后加入氯化鈷(終濃度150μmol/L)進(jìn)行缺氧,缺氧24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine2000說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為四組。A組為空白對(duì)照,不加siRNA和Lipofectamine2000;B組加入陰性對(duì)照siRNA和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000;C組加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000;D組加入SMG-1 siRNA和Lipofectamine2000。轉(zhuǎn)染6h后更換完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及150μmol/L氯化鈷),恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)48h后經(jīng)qRT-PCR和Western blot方法分別在mRNA和蛋白水平對(duì)SMG-1 siRNA沉默效果進(jìn)行驗(yàn)證,D組SMG-1表達(dá)量與A、B、C組相比有顯著性差異(P0.05)且D組與A組相比SMG-1表達(dá)抑制率大于50%可判定SMG-1基因被有效沉默。之后對(duì)A、B、C、D四組細(xì)胞分別進(jìn)行凋亡率檢測(cè)(采用流式細(xì)胞術(shù))和增殖抑制率檢測(cè)(采用CCK-8的方法),并提取總RNA和總蛋白,采用qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)四組細(xì)胞中STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平和STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平。3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究采用SPSS21.0軟件對(duì)所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料均以(?)±s來(lái)表示。兩組數(shù)據(jù)之間的分析比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1缺氧處理后SKOV3細(xì)胞SMG-1mRNA和蛋白的表達(dá)1.1缺氧處理后SKOV3細(xì)胞SMG-1mRNA的相對(duì)表達(dá)水平缺氧組SKOV3細(xì)胞中SMG-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為4.19±0.94,常氧組SMG-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為1.12±0.17,缺氧組與常氧組相比SMG-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.2缺氧處理后SKOV3細(xì)胞中SMG-1蛋白表達(dá)水平缺氧組SKOV3細(xì)胞中SMG-1蛋白表達(dá)水平為0.58±0.11,常氧組SMG-1蛋白表達(dá)水平為0.26±0.06,缺氧組與常氧組相比SMG-1蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細(xì)胞凋亡情況流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,A組細(xì)胞凋亡率為(5.7±1.22)%,B組細(xì)胞凋亡率為(6.6±0.87)%,C組細(xì)胞凋亡率為(6.9±1.35)%,D組細(xì)胞凋亡率為(10.2±0.70)%。D組細(xì)胞與A組、B組、C組相比凋亡率明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細(xì)胞增殖情況CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,A組作為參照,細(xì)胞增殖抑制率為0%。B組細(xì)胞增殖抑制率為(22.54±5.74)%、C組為(22.56±1.11)%、D組為(42.17±5.03)%,D組與B組、C組相比細(xì)胞增殖抑制率明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細(xì)胞中SMG-1和STAT3 mRNA的表達(dá)4.1缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細(xì)胞中SMG-1 mRNA的表達(dá)熒光定量PCR結(jié)果顯示,SKOV3細(xì)胞中SMG-1 mRNA的表達(dá)水平A組為1.00±0.07,B組為1.02±0.13,C組為0.88±0.07,D組為0.46±0.04。D組細(xì)胞中SMG-1 mRNA的表達(dá)水平與A組、B組和C組相比明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.2缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細(xì)胞中STAT3 mRNA的表達(dá)熒光定量PCR結(jié)果顯示,SKOV3細(xì)胞中STAT3 mRNA的表達(dá)水平A組為1.00±0.05,B組為0.98±0.10,C組為0.86±0.04,D組為0.68±0.08。D組細(xì)胞中STAT3 mRNA的表達(dá)水平與A組、B組和C組相比明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細(xì)胞中SMG-1、STAT3和p-STAT3蛋白的表達(dá)5.1缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細(xì)胞中SMG-1蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示,SKOV3細(xì)胞中SMG-1蛋白表達(dá)水平A組為0.38±0.06,B組為0.37±0.06,C組為0.38±0.03,D組為0.16±0.04。D組細(xì)胞中SMG-1蛋白表達(dá)水平與A組、B組和C組相比明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.2缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示,SKOV3細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)水平A組為0.59±0.05,B組為0.63±0.05,C組為0.71±0.05,D組為0.46±0.03。D組細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)水平與A組、B組和C組相比明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.3缺氧狀態(tài)下抑制SMG-1后SKOV3細(xì)胞中p-STAT3蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示,SKOV3細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)水平A組為0.56±0.03,B組為0.62±0.04,C組為0.61±0.04,D組為0.34±0.02。D組細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)水平與A組、B組和C組相比明顯降低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論缺氧可影響SMG-1表達(dá)水平;抑制SMG-1可影響STAT3的表達(dá)及活化,從而共同參與低氧SKOV3細(xì)胞凋亡進(jìn)程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張展;杜尚珂;岳寧;石瑛;張琳琳;劉麗莎;賈莉婷;于海洋;;沉默生殖器形成抑制基因-1對(duì)JAR細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)錄激活子3表達(dá)研究[J];中國(guó)婦幼保健;2015年33期

，

本文編號(hào)：1712263