芍藥(Paeonia lactiflora Pall.),和牡丹一樣,是我國傳統(tǒng)名花。長期的人工選擇培育出若干色彩、花型變異豐富的栽培品種,使其具有極高的觀賞價值。前人研究表明,芍藥的花型的變化主要來源于雌、雄蕊的瓣化和花瓣數(shù)目的自然增加兩個方面,但對于芍藥花型形成相關(guān)的分子機制缺乏較為深入的研究。鑒于此,本研究以芍藥花型中較為特殊的托桂型開展研究,以托桂型品種‘紫鳳羽’內(nèi)、外花瓣組織為材料,通過比較(無參)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析來篩選芍藥花型調(diào)控的相關(guān)基因;在此基礎(chǔ)上,對重要候選基因APETALA2(PlAP2)進(jìn)行RACE克隆、生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)特性以及啟動子區(qū)甲基化調(diào)控等功能驗證,同時從密碼子偏好性層面入手,利用多元統(tǒng)計分析探討芍藥轉(zhuǎn)錄組及該關(guān)鍵候選基因密碼子使用模式。主要研究結(jié)果如下:1.芍藥‘紫鳳羽’內(nèi)、外花瓣組織RNA-seq 比較轉(zhuǎn)錄組分析芍藥‘紫鳳羽’內(nèi)、外花瓣的組織RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示,共獲得394.46 Mb個讀長(cleanreads),43,704個具有功能注釋的非重復(fù)序列基因(Unigenes),內(nèi)、外花瓣兩組之間存在979個差異表達(dá)基...

【文章頁數(shù)】：153 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 植物花器官發(fā)育的分子研究進(jìn)展
    2 RNA-seq轉(zhuǎn)錄組和iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析在植物分子研究中的應(yīng)用
    3 密碼子使用偏好性在植物分子研究中的應(yīng)用
    4 DNA甲基化修飾在植物分子研究中的應(yīng)用
    5 本研究的目的及意義
第二章 芍藥‘紫鳳羽’內(nèi)、外花瓣組織RNA-seq比較轉(zhuǎn)錄組分析
    1 材料與方法
        1.1 植物材料
        1.2 總RNA提取、文庫建立及上機測序
        1.3 轉(zhuǎn)錄組RNA-seq測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析
            1.3.1 原始數(shù)據(jù)過濾處理
            1.3.2 Unigenes功能注釋
            1.3.3 Unigenes表達(dá)量計算
            1.3.4 差異表達(dá)Unigenes篩選
            1.3.5 差異表達(dá)Unigenes功能注釋和pathway通路分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估
        2.2 Unigenes的功能注釋
        2.3 差異表達(dá)基因篩選及功能富集分析
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第三章 芍藥‘紫鳳羽’內(nèi)、外花瓣組織iRAQ比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析及候選基因篩選
    1 材料與方法
        1.1 植物材料
        1.2 蛋白提取和樣品處理
        1.3 酶解和除鹽
        1.4 iTRAQ標(biāo)記和分組分
        1.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析和蛋白質(zhì)鑒定
        1.6 蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)分析
            1.6.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制
            1.6.2 PCA主成分分析
            1.6.3 PLS-DA圖分析
            1.6.4 HCA圖分析
            1.6.5 差異表達(dá)蛋白篩選
            1.6.6 GO功能富集分析
            1.6.7 KEGG-pathway通路富集分析
        1.7 芍藥花型調(diào)控的重要候選基因篩選
        1.8 引物設(shè)計
        1.9 Western blot驗證
    2 結(jié)果與分析
        2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜檢測質(zhì)量評估
        2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)質(zhì)量評估
        2.3 差異表達(dá)蛋白篩選以及功能富集分析
        2.4 基于轉(zhuǎn)錄組與蛋白組聯(lián)合分析篩選芍藥花型調(diào)控的重要候選基因
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第四章 芍藥花型調(diào)控候選基因PlAP2克隆及其表達(dá)特性分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 主要儀器
        1.3 花瓣形態(tài)指標(biāo)測定
        1.4 花瓣解剖結(jié)構(gòu)觀察
        1.5 引物設(shè)計
        1.6 RNA提取、RACE克隆測序
            1.6.1 組織總RNA提取
            1.6.2 cDNA末端快速擴增(RACE)
            1.6.3 PCR擴增產(chǎn)物回收與鑒定
        1.7 序列分析
            1.7.1 編碼序列確定及同源性分析
            1.7.2 蛋白理化性質(zhì)與基本結(jié)構(gòu)預(yù)測
            1.7.3 蛋白功能位點及保守功能域分析
            1.7.4 亞細(xì)胞定位分析
        1.8 定量表達(dá)分析
        1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 芍藥花型調(diào)控關(guān)鍵基因PlAP2基因克隆及序列分析
        2.2 蛋白結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學(xué)分析
            2.2.1 基本理化性質(zhì)
            2.2.2 跨膜螺旋與疏水性
            2.2.3 信號肽預(yù)測
            2.2.4 糖基化和磷酸化位點
            2.2.5 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
            2.2.6 保守功能域分析
            2.2.7 亞細(xì)胞定位分析
        2.3 芍藥‘紫鳳羽’品種內(nèi)、外花瓣形態(tài)特征檢測
        2.4 芍藥花型調(diào)控關(guān)鍵基因PlAP2基因表達(dá)特性分析
            2.4.1 總RNA質(zhì)量檢測
            2.4.2 擴增曲線與熔解曲線分析
            2.4.3 PlAP2基因在芍藥‘紫鳳羽’不同發(fā)育時期內(nèi)、外瓣間的組織表達(dá)差異分析
            2.4.4 PlAP2基因在芍藥托桂型不同品種內(nèi)、外花瓣間的組織表達(dá)差異分析
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第五章 芍藥花型調(diào)控候選基因PlAP2啟動子區(qū)甲基化修飾分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
        1.2 引物設(shè)計
        1.3 染色體步移
            1.3.1 基因組DNA的獲取
            1.3.2 巢式PCR擴增
        1.4 啟動子區(qū)生物信息學(xué)分析
        1.5 甲基化測序分析
            1.5.1 原始測序讀長
            1.5.2 測序質(zhì)量評估
            1.5.3 參考序列比對分析
            1.5.4 胞嘧啶甲基化水平分析
        1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 芍藥PlAP2基因5'上游啟動子區(qū)克隆及序列分析
        2.2 芍藥不同發(fā)育時期花瓣P(guān)lAP2基因啟動子CpG島區(qū)域甲基化分析
        2.3 芍藥PlAP2基因甲基化水平與mRNA表達(dá)相關(guān)性分析
        2.4 芍藥PlAP2基因重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點篩選
    3 討論
    4 本章小結(jié)
第六章 芍藥轉(zhuǎn)錄組及AP2基因密碼子使用模式分析
    第一節(jié) 基于RNA-seq的芍藥轉(zhuǎn)錄組密碼子使用模式分析
        1 材料與方法
            1.1 芍藥轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)來源
            1.2 堿基組成分析及中性繪圖
            1.3 同義密碼子使用偏好性分析
            1.4 ENC繪圖分析
            1.5 對應(yīng)性分析
            1.6 PR2繪圖分析
            1.7 最優(yōu)密碼子測定
            1.8 統(tǒng)計分析
        2 結(jié)果與分析
            2.1 GC含量分布以及中性繪圖
            2.2 ENC與GC3s的關(guān)聯(lián)分析
            2.3 PR2-plot分析
            2.4 對應(yīng)性分析COA
            2.5 突變壓力和選擇作用對芍藥轉(zhuǎn)錄組密碼子使用模式的影響
            2.6 最優(yōu)密碼子(Optimal codons)分析
        3 討論
        4 本節(jié)小結(jié)
    第二節(jié) 芍藥等8個物種AP2基因密碼子使用模式分析
        1 材料與方法
            1.1 序列數(shù)據(jù)來源
            1.2 堿基組成與密碼子偏好性分析
                1.2.1 堿基組成
                1.2.2 同義密碼子相對使用度RSCU
                1.2.3 有效密碼子數(shù)ENC
                1.2.4 最優(yōu)密碼子頻率Fop
                1.2.5 ENC繪圖分析(ENC-plot)
            1.3 基因表達(dá)評估分析
            1.4 基于密碼子使用偏性的聚類分析
            1.5 統(tǒng)計分析
        2 結(jié)果與分析
            2.1 不同植物AP2的密碼子與GC偏好性(GC3s)的關(guān)系
            2.2 不同植物AP2基因的密碼子堿基組成和最優(yōu)密碼子測定
            2.3 不同植物AP2基因的相對同義密碼子使用度
            2.4 基于密碼子使用模式探討不同植物AP2基因間進(jìn)化關(guān)系
            2.5 不同植物AP2基因選擇壓力的影響
        3 討論
        4 本節(jié)小結(jié)
全文結(jié)論
本研究創(chuàng)新點
本研究下一步工作計劃
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3873542