番茄常用于植物科學研究,是重要模式植物之一,也是我國重要的蔬菜作物。全球氣候變暖、水資源短缺以及設(shè)施栽培中土壤鹽漬化造成的高鹽、低溫、高溫、干旱等非生物脅迫因子影響著番茄生長發(fā)育和生產(chǎn)力。從分子生物學的角度闡明植物抗逆性基因的功能成為了改良植物抗逆性的重要基礎(chǔ)。GAMYB是GA信號應(yīng)答途徑中的一個轉(zhuǎn)錄因子。GAMYB也受到脅迫激素ABA(abscisicacid)的調(diào)控。然而在番茄中GAMYB是否能提高植物的脅迫抗性鮮有報道。本研究克隆了番茄中GAMYB同源基因SlGAMYBL2,在煙草植株中異源超表達,并對轉(zhuǎn)基因煙草進行表型鑒定和生理生化分析,研究番茄SlGAMYBL2在非生物脅迫中的功能,結(jié)果如下:1.SlGAMYBL2具有GAMYB典型的R2R3 DNA結(jié)構(gòu)域,C端具有2個特殊的保守區(qū)域(BOX1,BOX2),從MEGA軟件構(gòu)建的進化樹同樣可以看出,SlGAMYBL2編碼的蛋白屬于GAMYB家族,與大麥HvGAMYB親緣性較高。通過對其上游序列分析,除了發(fā)現(xiàn)具有典型的啟動子核心序列外,還具有能響應(yīng)非生物脅迫的順式作用元件。2.利用DNA重組技術(shù)成功構(gòu)建了 35S啟動子驅(qū)動SlGA...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮列表
技術(shù)路線圖
1 前言
    1.1 研究背景
    1.2 番茄的研究進展
        1.2.1 番茄抗冷性的研究
        1.2.2 番茄抗旱性的研究
        1.2.3 番茄耐鹽性的研究
    1.3 MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究概況
    1.4 GAMYB的研究概況
        1.4.1 GAMYB在種子萌發(fā)中的作用
        1.4.2 GAMYB在開花誘導(dǎo)中的作用
        1.4.3 GAMYB在花藥發(fā)育中的作用
        1.4.4 GAMYB在激素信號途徑中的作用
        1.4.5 GAMYB互作蛋白
        1.4.6 參與GAMYB調(diào)控的相關(guān)基因miR159
    1.5 研究的內(nèi)容以及選題的意義與目的
        1.5.1 研究的內(nèi)容
        1.5.2 選題的意義
        1.5.3 選題的目的
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌種及載體
        2.1.3 試劑
        2.1.4 儀器設(shè)備
        2.1.5 培養(yǎng)基的配方
    2.2 方法
        2.2.1 SlGAMYBL2進行生物信息學分析
        2.2.2 SlGAMYBL2在番茄中組織表達模式分析
            2.2.2.1 番茄材料的處理
            2.2.2.2 番茄總RNA的提取
            2.2.2.3 電泳檢測RNA
            2.2.2.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
            2.2.2.5 熒光定量PCR檢測基因的表達水平
        2.2.3 中間載體的構(gòu)建
            2.2.3.1 目的基因的PCR擴增
            2.2.3.2 PCR產(chǎn)物回收
            2.2.3.3 目標片段與pEASY-Blunt克隆載體的連接反應(yīng)
            2.2.3.4 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
            2.2.3.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞
            2.2.3.6 菌落PCR對陽性轉(zhuǎn)化子的檢測
            2.2.3.7 質(zhì)粒的提取
            2.2.3.8 質(zhì)粒的酶切驗證
        2.2.4 SlGAMYBL2超表達載體的構(gòu)建
            2.2.4.1 克隆載體pEASY-SlGAMYBL2和表達載體P35S的雙酶切
            2.2.4.2 目的片段與表達載體的連接
            2.2.4.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.2.4.4 菌落PCR對陽性轉(zhuǎn)化子的檢測
            2.2.4.5 質(zhì)粒的提取
            2.2.4.6 陽性重組體的鑒定
        2.2.5 遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.5.1 根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞EHA105的制備
            2.2.5.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(凍融法)
            2.2.5.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化
                2.2.5.3.1 無菌苗的獲得
                2.2.5.3.2 農(nóng)桿菌準備
                2.2.5.3.3 葉片的侵染
                2.2.5.3.4 抗性植株篩選
                2.2.5.3.5 生根培養(yǎng)
            2.2.5.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株的檢測
                2.2.5.4.1 轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR篩選
                2.2.5.4.2 轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色鑒定
                2.2.5.4.3 轉(zhuǎn)基因植株的表型分析
        2.2.6 轉(zhuǎn)基因株系的抗逆試驗
            2.2.6.1 轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)實驗
            2.2.6.3 煙草幼苗非生物脅迫處理
        2.2.7 生理指標測定
            2.2.7.1 電導(dǎo)率的測定
            2.2.7.2 保水性實驗
            2.2.7.3 酶液提取
            2.2.7.4 SOD酶測定
            2.2.7.7 過氧化氫酶(CAT)測定
            2.2.7.8 過氧化物酶(POD)測定
            2.2.7.9 丙二醛(MDA)含量測定
3 結(jié)果與分析
    3.1 SlGAMYBL2的氨基酸序列對比和進化樹分析
    3.2 SlGAMYBL2基因在脅迫和外源激素處理下的表達分析
    3.3 SlGAMYBL2超表達載體的構(gòu)建
    3.4 SlGAMYBL2超表達載體轉(zhuǎn)化煙草
    3.5 PCR驗證轉(zhuǎn)基因植株
    3.6 轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色驗證
    3.7 表型的分析
    3.8 種子萌發(fā)結(jié)果分析
    3.9 非生物脅迫處理下煙草幼苗的根長分析
    3.10 非生物脅迫下生理指標的分析
        3.10.1 相對電導(dǎo)率
        3.10.2 丙二醛(MDA)含量測定
        3.10.3 保水性
        3.10.4 超氧化物歧化酶(SOD)酶活性的測定
        3.10.5 過氧化氫酶(CAT)活性的測定
        3.10.6 過氧化物酶(POD)活性的測定
4 結(jié)論與討論
    4.1 結(jié)論
    4.2 討論
        4.2.1 SlGAMYBL2基因提高了植株的抗逆性
        4.2.2 SlGAMYBL2的氨基酸序列對比和進化樹分析
        4.2.3 超表達載體的構(gòu)建
        4.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與表型的鑒定
        4.2.5 超表達SlGAMYBL2提高了轉(zhuǎn)基因煙草細胞膜穩(wěn)定性
        4.2.6 超表達SlGAMYBL2提高了轉(zhuǎn)基因煙草抗氧化酶活性
    4.3 后續(xù)工作的設(shè)想
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表論文情況



本文編號：3873968