發(fā)布時(shí)間：2018-06-12 09:48

  本文選題：桃 + 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白　； 參考：《河南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：桃(Prunus Persica(L.)Batsch.)因其營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特在園藝產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位。桃果實(shí)的品質(zhì)受多種因素影響,如光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和積累。蔗糖作為碳水化合物的主要存在形式,在源葉合成后經(jīng)過(guò)韌皮部的運(yùn)輸?shù)竭_(dá)各庫(kù)器官,如果實(shí)中。桃果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量很大程度上取決于所含碳水化合物的種類和數(shù)量。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為碳水化合物裝載進(jìn)韌皮部,且從合成部位運(yùn)輸?shù)接行枨蠼M織部位的主要介質(zhì),負(fù)責(zé)蔗糖的裝載、卸載和分配。通過(guò)研究蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用機(jī)制,可以幫助理解決定果實(shí)生長(zhǎng)和品質(zhì)的蔗糖積累的過(guò)程。因此,對(duì)植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的深入探索研究是很有必要的。該試驗(yàn)在本課題組的研究基礎(chǔ)上,從桃中克隆出桃蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的3個(gè)成員PpSUT1,PpSUT2和PpSUT4,利用缺陷型酵母對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證,通過(guò)對(duì)PpSUT2進(jìn)行原核表達(dá),制備了多克隆抗體,并對(duì)桃各組織中PpSUT2的蛋白表達(dá)進(jìn)行分析,為基因的免疫細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作因子等研究提供了重要依據(jù)。主要作了如下幾項(xiàng)研究:1.桃SUTs的克隆和序列分析從桃中克隆出其蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因PpSUT1(KU230443),PpSUT2(KJ152144)和PpSUT4(KU198999)分別與桃基因組序列ppa004033m,ppa003041m和ppa004620m相一致。此處得到的PpSUT2基因含有長(zhǎng)度為1830bp的ORF,比此前克隆的PpSUT2(1782bp)多出47個(gè)堿基,編碼長(zhǎng)度為609個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。2.桃SUTs在酵母中的功能分析通過(guò)構(gòu)建酵母表達(dá)載體,將桃的3個(gè)SUT基因在具有蔗糖吸收缺陷的酵母菌株SUSY7/ura3中進(jìn)行異源表達(dá),PpSUT1、PpSUT2和PpSUT4在SD-蔗糖培養(yǎng)基上都表現(xiàn)出了功能的互補(bǔ),表明這3個(gè)桃蔗糖運(yùn)蛋白基因都分別編碼一個(gè)具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的功能性蛋白。3.桃PpSUT2的原核表達(dá)及抗體制備根據(jù)PpSUT2基因的ORF序列,構(gòu)建p ET32a-PpSUT2重組質(zhì)粒,在表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)Plys S中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),所得到融合蛋白的分子量約為84k D。以純化的PpSUT2-His蛋白為抗原進(jìn)行兔免疫,用間接ELISA對(duì)抗血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè),其效價(jià)達(dá)到了1:12800,Western blot分析顯示該抗體能特異性識(shí)別PpSUT2融合蛋白,表明制備的PpSUT2多克隆抗體具有較高的檢測(cè)靈敏度和特異性。4.桃PpSUT2的蛋白組織特異性表達(dá)提取桃不同組織的總蛋白,進(jìn)行Western blot檢測(cè),在分子量84kD左右處出現(xiàn)特異的蛋白質(zhì)條帶,證明所制備的抗體可以特異性識(shí)別桃PpSUT2蛋白,并且在桃的各個(gè)組織器官中都檢測(cè)到了PpSUT2蛋白的表達(dá),通過(guò)分析PpSUT2蛋白的表達(dá)模式,推測(cè)其功能是在果實(shí)發(fā)育期負(fù)責(zé)韌皮部蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和卸載,還有可能起到信號(hào)蛋白的功能。
[Abstract]:Prunus Persica L. Batsch. Because of its rich nutrition, unique flavor occupies an important position in horticultural industry. The quality of peach fruit is affected by many factors, such as the transformation and accumulation of photosynthetic products. Sucrose, as the main carbohydrate form, is transported through phloem to the storage organs after the source leaves are synthesized. The quality and yield of peach fruits depend to a great extent on the kinds and quantities of carbohydrates contained. Sucrose transporters are used as carbohydrates into the phloem and are transported from the synthetic site to the required tissue sites, which are responsible for the loading, unloading and distribution of sucrose. The study of the mechanism of sucrose transporter can help to understand the process of sucrose accumulation which determines the growth and quality of fruit. Therefore, it is necessary to explore the plant sucrose transporter. Three members of the peach sucrose transporter family, PpSUT1, PpSUT2 and PpSUT4, were cloned from peach on the basis of our research. The protein expression of PpSUT2 in peach tissues was analyzed, which provided an important basis for the study of immunocyte localization of genes and protein interaction factors. The following studies were carried out: 1. Cloning and sequence analysis of sucrose transporter family genes PpSUT1 (KU230443) and PpSUT4 (KJ152144) and PpSUT4 (KU198999) were cloned from peach, respectively, which were consistent with the genomic sequence ppa004033mppa003041m and ppa004620m, respectively. The obtained PpSUT2 gene contains an ORF with a length of 1830bp, which is 47 bases longer than the previously cloned PpSUT2Amino 1782bp) and encodes a 609 amino acid protein. Functional Analysis of Peach SUTs in Saccharomyces cerevisiae by constructing yeast expression Vectors, three sut genes of peach were expressed in sucrose deficient yeast strain SUSY7 / ura3. Both PpSUT1, PpSUT2 and PpSUT4 showed complementary functions on SD-sucrose medium. These three sucrose transporter genes all encode a functional protein. 3 with sucrose transport activity. Prokaryotic expression of PpSUT2 and preparation of PpSUT2 antibody the recombinant plasmid of pET32a-PpSUT2 was constructed according to the ORF sequence of PpSUT2 gene. The recombinant plasmid was induced by IPTG to express pET32a-PpSUT2. The molecular weight of the fusion protein was about 84kD. The purified PpSUT2-His protein was used as antigen to immunize rabbits. The titer of PpSUT2 fusion protein was detected by indirect Elisa. The titer of the purified PpSUT2-His protein reached 1: 12800m Western blot analysis showed that the antibody could specifically recognize PpSUT2 fusion protein. The results showed that the PpSUT2 polyclonal antibody had high detection sensitivity and specificity. 4. The protein specific expression of PpSUT2 was used to extract the total proteins from different peach tissues. Western blot was used to detect the specific protein bands at the molecular weight of 84kD. It was proved that the prepared antibody could specifically recognize the PpSUT2 protein of peach. The expression of PpSUT2 protein was detected in all tissues and organs of peach. By analyzing the expression pattern of PpSUT2 protein, it was inferred that the function of PpSUT2 protein was to transport and unload sucrose in phloem during fruit development, and it might also play the role of signal protein.
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S662.1

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本文編號(hào)：2009259