本文關(guān)鍵詞：釕多吡啶配合物（Ru1）對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制研究

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【摘要】：研究目的與意義鉑類金屬抗腫瘤藥物在1978年成功上市應(yīng)用后,將人們對(duì)抗腫瘤藥物的研究興趣吸引到了全新領(lǐng)域,從此開啟了研究金屬類抗腫瘤藥的新紀(jì)元。但在臨床使用鉑類藥物過程中,發(fā)現(xiàn)該類藥物具有強(qiáng)烈的毒副作用,且抗腫瘤普窄等限制了該類藥物的廣泛使用。為了突破這些束縛,具有抗腫瘤活性強(qiáng),抗腫瘤譜廣且毒副作用小的新金屬類抗腫瘤藥成為了研究熱點(diǎn),學(xué)者們將思路轉(zhuǎn)移到了在元素周期表中與鉑同屬Ⅷ族的釕金屬,釕元素具有與鉑類金屬類似的理化特性,但毒副作用更低,被認(rèn)為經(jīng)過適當(dāng)結(jié)構(gòu)修飾后可成為最具前途的抗腫瘤藥物之一。NAMI-A及KP1019兩個(gè)釕配合物成功進(jìn)入臨床試驗(yàn),更是激發(fā)了人們對(duì)釕金屬的極大研究熱情�？蒲腥藛T對(duì)釕金屬進(jìn)行了大量的結(jié)構(gòu)修飾,得到了大量新型的釕配合物,同時(shí)部分配合物具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用已經(jīng)得到確認(rèn)。我們課題組在前期工作中,觀察了多種新合成釕多吡啶配合物的抗腫瘤活性,本實(shí)驗(yàn)將在原有工作基礎(chǔ)上,選取釕多吡啶配合物([Ru(bpy)_2(taptp)](ClO_4)_2(Ru1)),進(jìn)一步研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用,并探討其作用相關(guān)機(jī)制本研究首先篩選對(duì)該新型釕多吡啶配合物(Ru1)敏感的腫瘤細(xì)胞,檢測Ru1對(duì)細(xì)胞的抑制作用,從DNA損傷水平探討其可能的作用機(jī)制,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為釕配合物的研究奠定基礎(chǔ),為設(shè)計(jì)開發(fā)、篩選高效和毒副作用低的金屬類抗腫瘤藥提供寶貴的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法釕配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響本研究選取了SGC-7901、Hela、MDA-MB-231細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,各種腫瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度的[Ru(bpy)_2(taptp)](ClO_4)_2(Ru1)處理24h后,采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測Ru1對(duì)受試腫瘤細(xì)胞的抑制率并計(jì)算IC50值;結(jié)晶紫染色法檢測經(jīng)配合物作用后腫瘤細(xì)胞數(shù)量變化情況,從中選取對(duì)Ru1較敏感的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。腫瘤細(xì)胞對(duì)釕配合物的內(nèi)吞作用以MTT實(shí)驗(yàn)工作為基礎(chǔ),將對(duì)配合物(Ru1)較為敏感的SGC-7901細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用Ru1分別作用12h,通過DAPI染色,利用Ru1本身自帶熒光與DAPI的熒光相互疊加對(duì)照,檢測Ru1在SGC-7901細(xì)胞內(nèi)的分布情況。釕配合物對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響為了深入研究Ru1抑制腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制是否與SGC-7901細(xì)胞周期相關(guān)聯(lián),故通過乙醇固定法聯(lián)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測經(jīng)過Ru1處理SGC-7901細(xì)胞24h后,細(xì)胞周期的分布情況。釕配合物對(duì)SGC-7901細(xì)胞DNA的影響為了進(jìn)一步探究Ru1是否以DNA為作用靶標(biāo)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的作用,通過彗星實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證經(jīng)過Ru1處理SGC-7901細(xì)胞24h后,細(xì)胞DNA的損傷程度。釕配合物對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響在探討Ru1阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程基礎(chǔ)上,采用Annexin V/PI雙染色法檢測經(jīng)不同濃度Ru1處理后,SGC-7901細(xì)胞的凋亡情況。釕配合物對(duì)SGC-7901細(xì)胞DNA損傷相關(guān)蛋白及凋亡蛋白表達(dá)的影響在探討Ru1引起SGC-7901細(xì)胞周期阻滯及DNA損傷基礎(chǔ)上,采用western blot技術(shù)檢測經(jīng)不同濃度Ru1處理后細(xì)胞DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,包括ATR和phospho-ATR、H2AX和γH2AX、p53和phospho-p53、ERK1/2和P-ERK1/2、Bcl-2和Bax。通過檢測細(xì)胞DNA相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況,研究Ru1抑制SGC-7901細(xì)胞增殖的相關(guān)通路機(jī)制。結(jié)果1.釕配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示,Ru1對(duì)體外培養(yǎng)的三種腫瘤細(xì)胞(SGC-7901、Hela與MDA-MB-231細(xì)胞)均表現(xiàn)較強(qiáng)的增殖抑制作用,抑制率具有濃度依賴性,且Ru1對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制增殖效果最佳,IC50值為26.5μM。結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果也說明Ru1可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖,與MTT結(jié)論相吻合。通過篩選比較后選擇SGC-7901細(xì)胞以作后續(xù)試驗(yàn)研究。Ru1對(duì)羊水細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示Ru1對(duì)SGC-7901細(xì)胞的毒性作用要強(qiáng)于羊水細(xì)胞。2.腫瘤細(xì)胞對(duì)釕配合物的內(nèi)吞作用根據(jù)內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,釕配合物明亮紅色熒光主要集中在細(xì)胞核區(qū)域,且隨著配合物濃度的增加,紅色熒光也呈現(xiàn)加強(qiáng)趨勢。由此可說明,SGC-7901細(xì)胞能將Ru1吞入胞內(nèi),且Ru1主要集中分布在細(xì)胞核區(qū)域。3.釕配合物對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響周期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,Ru1處理SGC-7901細(xì)胞24h后,SGC-7901細(xì)胞周期發(fā)生了改變。Ru1能顯著阻滯SGC-7901細(xì)胞周期于G0/Gl期。4.釕配合物對(duì)SGC-7901細(xì)胞DNA的影響彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,SGC-7901細(xì)胞經(jīng)Ru1處理24后,與正常對(duì)照組相比,細(xì)胞尾部長度、彗星長、細(xì)胞尾矩、Olive尾矩均隨濃度遞增呈增加趨勢,差異有顯著意義(*P0.05,**P0.01),證明Ru1對(duì)SGC-7901細(xì)胞DNA有損傷作用。5.釕配合物對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Ru1作用于SGC-7901細(xì)胞24h后可導(dǎo)致SGC-7901細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡,與正常對(duì)照組相比,Ru1處理組細(xì)胞凋亡率均呈顯著性差異(*P0.05,**P0.01),而且這種致凋亡作用呈劑量依賴性。6.釕配合物對(duì)SGC-7901細(xì)胞DNA損傷相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果揭示,Ru1可激活A(yù)TR,呈劑量依賴性增加phospho-ATR,p53,phospho-p53,phospho-ERK1/2及Bax蛋白的表達(dá),同時(shí)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)論1.釕多吡啶配合物(Ru1)對(duì)三種腫瘤細(xì)胞SGC-7001、Hela、MDA-MB-231細(xì)胞有增殖抑制作用,對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制作用最明顯。2.SGC-7901細(xì)胞將Ru1吞入胞內(nèi),且能將Ru1運(yùn)輸至細(xì)胞核區(qū)域。3.Ru1能抑制SGC-7901細(xì)胞增殖抑制過程,可使阻滯細(xì)胞周期于G0/Gl期,阻滯作用具有濃度依賴性。4.Ru1作用靶標(biāo)為細(xì)胞DNA,可導(dǎo)致SGC-7901細(xì)胞DNA損傷斷裂,同時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡,且這些作用具有濃度依賴性。。5.Ru1抑制SGC-7901腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制是誘導(dǎo)DNA損傷和激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn),磷酸化系列細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白(phospho-ATR,p53,phospho-p53,phospho-ERK1/2,Bax和下調(diào)Bcl-2等發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。
【關(guān)鍵詞】：釕配合物 增殖 細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn) DNA損傷
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 摘要6-10
• ABSTRACT10-14
• 第一章 前言14-22
• 1.1 引言14-15
• 1.2 金屬抗腫瘤藥物的研究進(jìn)展15-17
• 1.2.1 鉑類金屬抗腫瘤藥15-16
• 1.2.2 釕金屬配合物抗腫瘤藥16-17
• 1.2.3 其他金屬抗腫瘤藥物17
• 1.3 細(xì)胞DNA損傷檢控點(diǎn)17-19
• 1.4 研究內(nèi)容與方法19-20
• 1.5 研究創(chuàng)新點(diǎn)20-21
• 1.6 研究的技術(shù)路線21-22
• 第二章 釕配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響22-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器22-25
• 2.1.1 腫瘤細(xì)胞與藥物22-23
• 2.1.2 試劑與耗材23
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備23-24
• 2.1.4 主要試劑配制24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇25-26
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)26
• 2.2.3 細(xì)胞傳代26
• 2.2.4 細(xì)胞凍存26
• 2.2.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測釕配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用26-27
• 2.2.6 結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞毒性27-28
• 2.2.7 釕配合物對(duì)羊水細(xì)胞的作用28
• 2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理28
• 2.3 結(jié)果28-31
• 2.3.1 釕配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞SGC-7901、Hela、MDA-MB-231 的影響28-30
• 2.3.2 結(jié)晶紫染色結(jié)果30
• 2.3.3 釕配合物對(duì)羊水細(xì)胞的影響30-31
• 2.4 討論31-33
• 第三章 SGC-7901 細(xì)胞對(duì)釕配合物的內(nèi)吞作用33-37
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器33
• 3.1.1 腫瘤細(xì)胞與藥物33
• 3.1.2 主要試劑33
• 3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法33-34
• 3.2.1 蓋玻片處理33-34
• 3.2.2 細(xì)胞爬片34
• 3.2.3 加藥處理34
• 3.2.4 細(xì)胞固定及DAPI染色34
• 3.3 結(jié)果34-35
• 3.3.1 SGC-7901 細(xì)胞對(duì)釕配合物的內(nèi)吞情況34-35
• 3.4 討論35-37
• 第四章 釕配合物對(duì)SGC-7901 細(xì)胞周期的影響37-41
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器37
• 4.1.1 腫瘤細(xì)胞與藥物37
• 4.1.2 主要試劑37
• 4.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備37
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法37-38
• 4.2.1 細(xì)胞接種、加藥處理37-38
• 4.2.2 制備單細(xì)胞懸液38
• 4.2.3 乙醇固定細(xì)胞38
• 4.2.4 細(xì)胞染色38
• 4.2.5 統(tǒng)計(jì)分析38
• 4.3 結(jié)果38-40
• 4.3.1 釕配合物對(duì)SGC-7901 細(xì)胞的周期影響38-40
• 4.4.討論40-41
• 第五章 釕配合物對(duì)SGC-7901 細(xì)胞DNA及凋亡的影響41-50
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器41-42
• 5.1.1 腫瘤細(xì)胞與藥物41
• 5.1.2 主要試劑41-42
• 5.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備42
• 5.2 彗星實(shí)驗(yàn)方法42-43
• 5.2.1 玻片的準(zhǔn)備42
• 5.2.2 細(xì)胞接種、加藥處理42
• 5.2.3 單細(xì)胞的制備42
• 5.2.4 膠體的制備42-43
• 5.2.5 細(xì)胞的裂解43
• 5.2.6 電泳43
• 5.2.7 中和與染色43
• 5.2.8 彗星圖分析43
• 5.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)方法43-44
• 5.3.1 細(xì)胞接種、加藥處理43-44
• 5.3.2 制備單細(xì)胞懸液44
• 5.3.3 細(xì)胞染色44
• 5.3.4 統(tǒng)計(jì)分析44
• 5.4 結(jié)果44-47
• 5.4.1 釕配合物對(duì)SGC-7901 細(xì)胞DNA的損傷作用44-45
• 5.4.2 釕配合物對(duì)SGC-7901 細(xì)胞凋亡的損傷作用45-47
• 5.5 討論47-50
• 第六章 釕配合物對(duì)SGC-7901 細(xì)胞DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的影響50-62
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器50-53
• 6.1.1 腫瘤細(xì)胞與藥物50
• 6.1.2 主要試劑50-51
• 6.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備51
• 6.1.4 主要試劑配制51-53
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法53-57
• 6.2.1 細(xì)胞種板、加藥處理53
• 6.2.2 細(xì)胞蛋白樣品的制備53-54
• 6.2.3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的繪制54-55
• 6.2.4 測定細(xì)胞蛋白質(zhì)含量55
• 6.2.5 Western Blot55-57
• 6.3 結(jié)果57-60
• 6.3.1 釕配合物對(duì)SGC-7901 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響57-60
• 6.4 討論60-62
• 總結(jié)與展望62-63
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 附錄68-69
• 致謝69

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4 段亮;結(jié)直腸癌中炎性分子S100A9的表達(dá)與疾病進(jìn)展的關(guān)系及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖與遷移的作用及分子機(jī)制[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

5 王齊;Sam68對(duì)T-ALL細(xì)胞增殖和凋亡的作用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

6 黃正洋;表皮生長因子參與鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)理的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

7 桂琳;多細(xì)胞因子調(diào)控hsBAFF通過Erk1/2和S6K1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)B細(xì)胞增殖機(jī)理研究[D];南京師范大學(xué);2015年

8 李繼偉;氧化固醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白4L(ORP4L)通過維持細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)平衡促進(jìn)細(xì)胞增殖[D];暨南大學(xué);2016年

9 來凱然;環(huán)氧合酶-2在TNF-α誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)分化中的作用及其機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2016年

10 王洪領(lǐng);抗腫瘤新藥羧胺三唑抑制細(xì)胞增殖機(jī)制的初步研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2005年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫思;TGF-β調(diào)節(jié)仔豬睪丸支持細(xì)胞增殖的機(jī)制[D];西南大學(xué);2015年

2 王愿;ATO通過下調(diào)CD44對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 劉夢(mèng)涵;靶向抑制miRNA-21對(duì)K562細(xì)胞增殖及PTEN-PI3K/AKT通路的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 高曉晗;尼洛替尼聯(lián)合三氧化二砷對(duì)K562細(xì)胞增殖及凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 姚晶晶;地西他濱聯(lián)合三氧化二砷對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡的作用以及對(duì)DAPK基因影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 鄭雅文;Co-ASS對(duì)KB細(xì)胞增殖、凋亡及其機(jī)制的研究[D];蘭州大學(xué);2016年

7 黃銳;可溶性CD40配體對(duì)THP-1細(xì)胞增殖及PI3K、Akt mRNA表達(dá)的影響[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2016年

8 肖霞;5-Aza調(diào)控單核細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖、分化和遷移的機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2016年

9 袁媛;游離脂肪酸對(duì)甲狀腺細(xì)胞增殖的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

10 李娟;NOX4通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖[D];廣東藥科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：752127