本文關(guān)鍵詞：BCL-3調(diào)節(jié)由雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬的分子機(jī)制

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【摘要】：背景自噬是細(xì)胞在受到應(yīng)激的情況時(shí),為自己的生存提供物質(zhì)代謝所需的能量；或是正常情況下,自身器官正常新陳代謝的一種方式。據(jù)報(bào)道,自噬的發(fā)生與腫瘤的形成和發(fā)展有很大關(guān)系。BCL-3屬于IκB家族蛋白,它在NF-κB信號(hào)通路中起著重要的調(diào)控作用。另外,BCL-3在血液腫瘤和實(shí)體腫瘤中過(guò)度或者是失控的表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤的形成。目前有研究指出,BCL-3的表達(dá)會(huì)在一定程度上影響自噬,但是,對(duì)于BCL-3是如何影響自噬的過(guò)程,目前尚未明確。目的通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究,BCL-3的表達(dá)對(duì)雷帕霉素(Rapamycin)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的影響,并檢測(cè)其相關(guān)蛋白,從而闡述BCL-3影響自噬的可能機(jī)制。方法1.細(xì)胞培養(yǎng)：Hela細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM(High Glusose)培養(yǎng)基中,在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。平均約隔一天換一次培養(yǎng)液,注意調(diào)整細(xì)胞的密度盡量不超過(guò)1×106/mL。2.質(zhì)粒的購(gòu)買(mǎi)與提取：pGPU6/GFP/Neo-BCL-3-homo-558質(zhì)粒購(gòu)買(mǎi)于上海吉瑪公司,該質(zhì)粒是由上海吉瑪公司構(gòu)建的BCL-3的shDNA,靶序列為：GGGA GCTCGACATCTACAACA,其模板的序列為S：CACCGGGAGCTCGACATCT ACAA CATTCAAGAGATGTTGTAGATGTCGAGCTCCCTTTTTTG; A:GATCCAAA AAAG GGAGCTCGACATCTACAACATCTCTTGAATGTTGTAGATGTCGAGCTCCC。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用lipofectamine 2000將shBCL-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞,同時(shí)將NC-shRNA作為對(duì)照轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后4-6h后完全更換含雙抗、血清的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24h后觀察細(xì)胞熒光表達(dá),然后提取蛋白。4.藥物處理：使用濃度為1μM的rapamycin處理Hela細(xì)胞,使用Western blot的方法檢測(cè)相關(guān)分子的變化情況。5.指標(biāo)檢測(cè)：在rapamyin處理組與未處理組的Hela細(xì)胞中提取蛋白,用Westernblot檢測(cè)BCL-3、LC3等蛋白表達(dá)情況；質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染及rapamycin等藥物處理HeLa細(xì)胞后共聚焦顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3的表達(dá)及分布情況。結(jié)果驗(yàn)證BCL-3質(zhì)粒和抗體,將NC和shBCL-3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞觀察熒光、提蛋白做Western blot觀察BCL-3表達(dá)量的變化。然后分組加藥并提蛋白做western blot驗(yàn)證LC3抗體。1. Western blot結(jié)果和免疫共聚焦結(jié)果顯示,用rapamycin誘導(dǎo)BCL-3干擾之后的Hela細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí),LC3水平較對(duì)照組會(huì)下降。2. Western blot結(jié)果顯示,在rapamycin誘導(dǎo)BCL-3干擾之后的Hela細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí),Atg5蛋白在BCL-3干擾后,其蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯變化。3. Western blot結(jié)果顯示,在rapamycin誘導(dǎo)BCL-3干擾之后的Hela細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí),Atg14和Vpsl5這兩個(gè)蛋白的表達(dá)會(huì)受到影響。它們會(huì)隨著B(niǎo)CL-3的干擾而下降。結(jié)論BCL-3對(duì)于雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬,起到一定的調(diào)控作用,這種調(diào)控作用可能是通過(guò)非經(jīng)典途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：BCL-3 自噬 非經(jīng)典途徑 Atg5 Atg14 Vps15
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R73-36
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-10
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料10-14
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法14-23
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-30
• 4. 討論30-33
• 5. 小結(jié)33-34
• 參考文獻(xiàn)34-37
• 綜述：自噬與BLC-337-61
• 參考文獻(xiàn)52-61
• 附錄61-62
• 致謝62-63
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷63

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 Zhaohua Gu;Yinyi Sun;Kangyong Liu;Fen Wang;Ting Zhang;Qiang Li;Liwei Shen;Ling Zhou;Liang Dong;Nan Shi;Qian Zhang;Wei Zhang;Meizhen Zhao;Xiaojiang Sun;;The role of autophagic and lysosomal pathways in ischemic brain injury[J];Neural Regeneration Research;2013年23期

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本文編號(hào)：752176