本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子FOXA1調(diào)控乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制以及互作蛋白的研究

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【摘要】：乳腺癌作為女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其全球發(fā)病率自上世紀(jì)70年代開(kāi)始一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。乳腺癌細(xì)胞由于具有無(wú)限增殖、遷移性和侵襲性等特點(diǎn),如果在乳腺癌發(fā)展后期才被檢查出,往往很難治愈。因此深入探究乳腺癌細(xì)胞的各類(lèi)信號(hào)通路以及尋找其中的靶基因十分重要。轉(zhuǎn)錄因子FOXA1屬于叉頭框FOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,與細(xì)胞的增殖、分化、胚胎成長(zhǎng)、器官發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理過(guò)程息息相關(guān)。大量研究結(jié)果表明,在腫瘤細(xì)胞中,FOXA1的表達(dá)情況與腫瘤分子分型和惡性程度高度關(guān)聯(lián)。我們猜測(cè)FOXAl能調(diào)控細(xì)胞EMT相關(guān)基因的表達(dá),可能是關(guān)鍵調(diào)控因子之一。本文主要研究FOXA1在乳腺癌細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制和互作蛋白的初步篩選鑒定。首先我們從臨床樣本出發(fā),檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)室有的幾十種臨床樣本的FOXA1、E鈣粘素、波形蛋白的蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在臨床樣本中FOXA1與上皮類(lèi)型標(biāo)志物E鈣粘素的蛋白表達(dá)呈正相關(guān),與間質(zhì)類(lèi)型標(biāo)志物波形蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。隨后檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)室不同類(lèi)型乳腺癌細(xì)胞中的FOXA1、E鈣粘素、波形蛋白的蛋白和mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中FOXA1表達(dá)高的細(xì)胞類(lèi)型E鈣粘素表達(dá)量也高,但波形蛋白表達(dá)水平低,由此我們得出在乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子FOXA1與上皮表型相關(guān)的結(jié)論。ZEB2可以直接抑制E鈣粘素的表達(dá),我們推鋇FOXA1可能參與調(diào)控ZEB2的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)細(xì)胞FOXA1表達(dá)水平的不同,我們選用乳腺癌E型細(xì)胞MCF-7和三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468作為細(xì)胞模型,在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染高表達(dá)FOXA1,發(fā)現(xiàn)ZEB2表達(dá)下降,上皮型標(biāo)志物E鈣粘素表達(dá)上升而間質(zhì)型標(biāo)志物波形蛋白表達(dá)下降。隨后通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行證實(shí),發(fā)現(xiàn)FOXA1能夠調(diào)控靶基因ZEB2的啟動(dòng)子并抑制其轉(zhuǎn)錄。為了尋找FOXA1的互作蛋白,更加深入的探究其在乳腺癌細(xì)胞信號(hào)通路中的功能,我們建立了His標(biāo)簽pull-down技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜分析的技術(shù)方法。首先我們構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-His-FOXA1,在HEK293T細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染高表達(dá)His-FOXA1蛋白,通過(guò)His標(biāo)簽pull down技術(shù)分離出FOXA1蛋白復(fù)合物,跑膠酶解后質(zhì)譜分析鑒定樣品中與轉(zhuǎn)錄因子FOXA1相互作用的蛋白質(zhì)。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析我們篩選出了8個(gè)可能與FOXA1互作的蛋白。這些研究為進(jìn)一步研究FOXA1在乳腺癌細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的互作關(guān)系及調(diào)控功能奠定了前期基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 轉(zhuǎn)錄因子FOXA1 ZEB2 EMT 蛋白互作
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 第1章 緒論13-21
• 1.1 癌癥13
• 1.2 乳腺癌與乳腺癌分型13-14
• 1.2.1 乳腺癌分型13
• 1.2.2 三陰性乳腺癌13-14
• 1.3 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化——EMT過(guò)程14-15
• 1.3.1 EMT標(biāo)志物15
• 1.3.2 轉(zhuǎn)錄因子ZEB2概述15
• 1.4 轉(zhuǎn)錄因子FOXA1概述15-17
• 1.4.1 FOXA1基因和蛋白結(jié)構(gòu)16
• 1.4.2 FOXA1的生物學(xué)功能16-17
• 1.5 蛋白互作研究方法介紹17-19
• 1.5.1 酵母雙雜交17-18
• 1.5.2 等離子共振18
• 1.5.3 免疫共沉淀18
• 1.5.4 噬茵體展示18-19
• 1.5.5 抗體與蛋白質(zhì)陣列19
• 1.5.6 熒光能量轉(zhuǎn)移19
• 1.6 本文研究背景及方法19-21
• 第2章 FOXA1的表達(dá)與乳腺癌上皮表型相關(guān)21-32
• 2.1 前言21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)儀器21-23
• 2.2.1 臨床樣本和乳腺癌細(xì)胞21
• 2.2.2 其它實(shí)驗(yàn)材料和儀器21-23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法23-29
• 2.3.1 乳腺癌臨床樣本23
• 2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)23-25
• 2.3.3 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄25-26
• 2.3.4 熒光定量PCR26
• 2.3.5 Western Blotting26-29
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論29-31
• 2.4.1 乳腺癌臨床樣本中FOXA1與上皮特性相關(guān)29-30
• 2.4.2 乳腺癌細(xì)胞中FOXA1蛋白表達(dá)檢測(cè)30-31
• 2.4.3 乳腺癌細(xì)胞中FOXA1、E-cadherin、vimentin mRNA表達(dá)水平檢測(cè)31
• 2.4.4 討論31
• 2.5 本章小結(jié)31-32
• 第3章 FOXA1調(diào)控下游靶基因ZEB232-41
• 3.1 前言32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)儀器32-34
• 3.2.1 細(xì)胞32
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器32-34
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法34-36
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)34
• 3.3.2 質(zhì)粒大提34-35
• 3.3.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染35
• 3.3.4 RNA的提取以及逆轉(zhuǎn)錄35
• 3.3.5 熒光定量PCR35-36
• 3.3.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)36
• 3.3.7 Western Blotting36
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論36-39
• 3.4.1 在乳腺癌臨床樣本中FOXA1與ZEB2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)36-37
• 3.4.2 微鏡下觀察MCF-7、MDA-MB-468細(xì)胞形態(tài)37
• 3.4.3 在MCF-7、MB468細(xì)胞中檢測(cè)內(nèi)源性FOXA1、ZEB2以及E-cadherin、vimentin的mRNA表達(dá)情況37-38
• 3.4.4 高表達(dá)FOXA1后,MB-468細(xì)胞中ZEB2和上皮間質(zhì)相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)38-39
• 3.4.5 FOXA1可以抑制ZEB2基因轉(zhuǎn)錄39
• 3.4.6 討論39
• 3.5 本章小結(jié)39-41
• 第4章 運(yùn)用His標(biāo)簽Pull-down技術(shù)對(duì)FOXA1互作蛋白的初步研究41-53
• 4.1 前言41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)儀器41-43
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法43-48
• 4.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)43
• 4.3.2 磷酸鈣轉(zhuǎn)染43-44
• 4.3.3 細(xì)胞總蛋白提取44
• 4.3.4 PCR擴(kuò)增人FOXA1基因44
• 4.3.5 基因與質(zhì)粒的酶切、純化、連接及轉(zhuǎn)化44-46
• 4.3.6 質(zhì)粒小提46
• 4.3.7 His標(biāo)簽pull-down技術(shù)46-47
• 4.3.8 SDS-PAGE電泳凝膠染色與Western印跡鑒定47
• 4.3.9 蛋白質(zhì)酶解47-48
• 4.3.10 LTQ質(zhì)譜檢測(cè)48
• 4.3.11 數(shù)據(jù)分析48
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論48-52
• 4.4.1 pcDNA-His-FOXA1真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定48-49
• 4.4.2 His標(biāo)簽pull-down技術(shù)流程的建立49-50
• 4.4.3 Western印跡鑒定pull-down產(chǎn)物50
• 4.4.4 Pull-down產(chǎn)物的SDS-PAGE分析50-51
• 4.4.5 質(zhì)譜分析51
• 4.4.6 討論51-52
• 4.5 本章小結(jié)52-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 附錄A 英文縮寫(xiě)59-60
• 附錄B 常用緩沖液和試劑配方60-62
• 附錄C 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文62-63
• 致謝63

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本文編號(hào)：747206