發(fā)布時(shí)間：2017-08-28 02:16

  本文關(guān)鍵詞：新型熒光探針檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建及其在miRNA-21和UDG檢測(cè)中的應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 分子信標(biāo) miRNA-21 UDG 肝癌 胃癌

【摘要】：近年來,熒光分子探針技術(shù)基于靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等特點(diǎn),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域。本論文通過設(shè)計(jì)和合成多種靶向性新型分子信標(biāo),在對(duì)其性能進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上,將其應(yīng)用到復(fù)雜生物樣品中的靶分子定量檢測(cè)、分析,結(jié)合經(jīng)典分子生物學(xué)研究手段進(jìn)一步探討分子信標(biāo)在臨床生物大分子檢測(cè)和診斷中的潛在應(yīng)用價(jià)值。本文的主要研究內(nèi)容如下:1.分子信標(biāo)用于腫瘤相關(guān)的miRNA-21表達(dá)水平的快速、簡單檢測(cè)本章以根據(jù)miRNA-21序列組成設(shè)計(jì)合成可特異性識(shí)別miRNA-21的分子信標(biāo)為工具,發(fā)展了一種基于分子信標(biāo)直接在總RNA中檢測(cè)miRNA-21的方法。在利用熒光波長掃描技術(shù)考察了分子信標(biāo)的熱穩(wěn)定性、雜交性能和特異性以及信標(biāo)與靶分子雜交條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,將該技術(shù)直接用于培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和人胃癌組織中的miRNA-21表達(dá)水平檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):具有良好的雜交性能和特異性的分子信標(biāo)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的下限可達(dá)到0.5 n M,能夠快速實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和組織中的miRNA表達(dá)水平差異性檢測(cè),結(jié)果表明:在17例標(biāo)本胃癌組織中有10例(59%)miRNA-21表達(dá)水平高于癌旁組織;檢測(cè)結(jié)果的可靠性進(jìn)一步通過q RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證;此外,采用Western blotting對(duì)miRNA-21直接調(diào)控的目的基因PDCD4和PTEN表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)與miRNA-21表達(dá)趨勢(shì)呈負(fù)相關(guān)。2.基于分子信標(biāo)結(jié)合酶促信號(hào)放大用于miRNA-21的超靈敏檢測(cè)本章目的是利用設(shè)計(jì)和合成莖部為RNA的新型嵌合分子信標(biāo)建立一種基于雙重信號(hào)放大系統(tǒng)超靈敏檢測(cè)miRNA的新方法。在通過熒光法考察該分子信標(biāo)的穩(wěn)定性、抗酶切能力以及雜交條件的基礎(chǔ)上,以體外合成的標(biāo)準(zhǔn)miRNA-21為檢測(cè)對(duì)象,發(fā)現(xiàn)這種具有雙重信號(hào)放大功能的分子信標(biāo)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)下限可以達(dá)到1p M,其靈敏度比純粹的分子信標(biāo)檢測(cè)法高3個(gè)數(shù)量級(jí)。進(jìn)一步用于胃癌組織樣品檢測(cè)結(jié)果表明:該方法可用于準(zhǔn)確檢測(cè)0.2μg總RNA中的miRNA-21表達(dá)水平。3.基于分子信標(biāo)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)UDG酶活性方法的建立及其應(yīng)用本章以含有損傷堿基尿嘧啶的嵌合型分子信標(biāo)作為酶促底物和信號(hào)報(bào)告分子,建立一種UDG酶的分析方法。通過實(shí)時(shí)熒光的方法來進(jìn)行UDG酶的活性分析和對(duì)UDG酶的熱動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察。結(jié)果表明UDG的檢測(cè)下限可以達(dá)到0.005 U/ml,UDG酶的KM和kcat值分別為0.89±0.1μM和210±10 min-1。接著將其用于UDG酶抑制劑的篩選,發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶和順鉑具有顯著UDG酶活性的功能,其IC50分別為6.1±0.52 m M和3.2±0.24 m M。最后將該方法用于不同肝癌細(xì)胞系和血清樣本中的UDG酶表達(dá)水平差異分析。
【關(guān)鍵詞】：分子信標(biāo) miRNA-21 UDG 肝癌 胃癌
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-26
• 1.1 分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)及原理12-13
• 1.2 新型分子信標(biāo)的種類13-17
• 1.3 分子信標(biāo)技術(shù)的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用17-21
• 1.3.1 分子信標(biāo)技術(shù)在miRNA檢測(cè)中的應(yīng)用17-18
• 1.3.2 分子信標(biāo)技術(shù)在蛋白質(zhì)檢測(cè)與分析中的應(yīng)用18-19
• 1.3.3 分子信標(biāo)技術(shù)在酶活性分析中的應(yīng)用19-21
• 1.4 miRNA檢測(cè)技術(shù)的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用21-24
• 1.4.1 miRNA傳統(tǒng)的檢測(cè)方法21
• 1.4.2 基于酶促信號(hào)放大檢測(cè)miRNA21-22
• 1.4.3 基于金納米材料檢測(cè)miRNA22-23
• 1.4.4 基于氧化石墨烯檢測(cè)miRNA23-24
• 1.5 本文的選題背景和研究意義24
• 1.6 本文擬開展的工作24-26
• 第2章 分子信標(biāo)用于腫瘤相關(guān)的miRNA-21的檢測(cè)26-43
• 2.1 前言26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分26-34
• 2.2.1 分子信標(biāo)檢測(cè)miRNA的實(shí)驗(yàn)原理26-27
• 2.2.2 試劑與儀器27-28
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法28-34
• 2.3 結(jié)果與討論34-42
• 2.3.1 分子信標(biāo)熱變性曲線的建立34
• 2.3.2 溫度和Mg~(2+)對(duì)分子信標(biāo)穩(wěn)定性的影響34-35
• 2.3.3 pH值和Mg~(2+)對(duì)分子信標(biāo)雜交性能的影響35-36
• 2.3.4 分子信標(biāo)信背比的考察36
• 2.3.5 分子信標(biāo)特異性的考察36-37
• 2.3.6 分子信標(biāo)雜交標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立37-38
• 2.3.7 細(xì)胞總RNA的提取與鑒定38
• 2.3.8 熒光法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中miRNA-2138-39
• 2.3.9 RT-RCR方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中miRNA-2139-41
• 2.3.10 熒光法檢測(cè)胃癌組織中miRNA-2141
• 2.3.11 RT-PCR方法檢測(cè)胃癌組織中miRNA-2141-42
• 2.3.12 miRNA-21調(diào)控的靶蛋白的檢測(cè)42
• 2.4 本章小結(jié)42-43
• 第3章 基于分子信標(biāo)結(jié)合酶促信號(hào)放大用于miRNA-21的超靈敏檢測(cè)43-56
• 3.1 前言43-44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分44-48
• 3.2.0 酶促信號(hào)放大檢測(cè)miRNA原理44
• 3.2.1 儀器和試劑44-45
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法45-48
• 3.3 結(jié)果與討論48-54
• 3.3.1 胃癌組織樣品的統(tǒng)計(jì)與鑒定48-49
• 3.3.2 分子信標(biāo)熱變性曲線的建立49
• 3.3.3 分子信標(biāo)信背比的考察49-50
• 3.3.4 分子信標(biāo)抗酶切能力的考察50-51
• 3.3.5 分子信標(biāo)雜交緩沖液條件的優(yōu)化51-52
• 3.3.6 標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)下限的確定52
• 3.3.7 DSN酶濃度條件的優(yōu)化52-53
• 3.3.8 信號(hào)放大檢測(cè)下限的確定53
• 3.3.9 胃癌組織樣品的檢測(cè)53-54
• 3.3.10 RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證54
• 3.4 本章小結(jié)54-56
• 第4章 基于分子信標(biāo)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)UDG酶活性方法的建立及其應(yīng)用56-66
• 4.1 前言56-57
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分57-59
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理57
• 4.2.2 試劑與儀器57-58
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)方法58-59
• 4.3 結(jié)果與討論59-65
• 4.3.1 UDG酶對(duì)分子信標(biāo)的影響59-60
• 4.3.2 分子信標(biāo)信背比的考察60
• 4.3.3 Mg~(2+)濃度對(duì)UDG酶活性的影響60-61
• 4.3.4 溫度對(duì)UDG酶活性的影響61
• 4.3.5 不同UDG酶濃度對(duì)反應(yīng)初速度的影響61-62
• 4.3.6 UDG酶動(dòng)力學(xué)的研究62
• 4.3.7 金屬離子對(duì)UDG酶活性的影響62-63
• 4.3.8 UDG酶抑制劑的選擇63
• 4.3.9 EDTA對(duì)復(fù)雜樣品體系中UDG酶的影響63-64
• 4.3.10 細(xì)胞樣品和血清樣品UDG酶含量的測(cè)定64-65
• 4.4 本章小結(jié)65-66
• 結(jié)論與展望66-67
• 參考文獻(xiàn)67-75
• 附錄 攻讀碩士學(xué)位期間參與發(fā)表論文和專利75-76
• 致謝76

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 湯佳音;房靜遠(yuǎn);;非編碼RNA在胃癌診治中的研究進(jìn)展[J];腫瘤;2014年06期

2 何文蕾;楊文杰;李媛媛;徐順清;;基于銀染增強(qiáng)的納米金探針定量檢測(cè)microRNA[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2008年11期

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本文編號(hào)：746919