本文關(guān)鍵詞：癌基因H-Ras過度表達(dá)抑制人成纖維細(xì)胞自噬

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【摘要】：研究背景原癌基因存在于正常細(xì)胞內(nèi),參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)與調(diào)控,進(jìn)而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖與分化,是維持機(jī)體正常生命活動(dòng)所必需的。癌基因是指在自然或?qū)嶒?yàn)條件下具有誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的潛在活性基因,大多數(shù)癌基因是從急性轉(zhuǎn)化性逆轉(zhuǎn)錄病毒中分離得到的,這些癌基因來(lái)源于真核細(xì)胞,當(dāng)涉及到癌基因的相應(yīng)細(xì)胞對(duì)應(yīng)物時(shí),也稱作原癌基因或細(xì)胞癌基因。Ras基因是癌基因的一種,其基因家族包括K-ras、H-ras和N-ras,在正常細(xì)胞中原癌基因Ras能促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng),當(dāng)其發(fā)生突變激活時(shí),能持續(xù)促進(jìn)細(xì)胞增殖,進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。但是研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)激活癌基因Ras不會(huì)使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,它需要在某些抑癌基因失活或其它的條件共同作用下才能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。研究指出在胰腺癌上皮細(xì)胞中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)K-ras的激活和p16抑癌基因的失活,在人胰腺上皮細(xì)胞中激活K-ras抑制p16可以使細(xì)胞繞過衰老,細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,在小鼠實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)缺失p16基因的小鼠致瘤率明顯增加,但是單獨(dú)的癌基因Ras只是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老而不能使纖維細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。癌基因Ras誘導(dǎo)的衰老如果在某些抑癌基因如p16缺失的條件下,可以使細(xì)胞繞過衰老,促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。癌基因的這種誘導(dǎo)細(xì)胞衰老來(lái)抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象,可能是由于細(xì)胞本身存在維穩(wěn)機(jī)制且腫瘤的形成是一個(gè)累積的漫長(zhǎng)的過程。研究發(fā)現(xiàn)除了細(xì)胞的衰老以外,癌基因Ras在誘導(dǎo)衰老的同時(shí)會(huì)改變細(xì)胞的自噬活性,且自噬在腫瘤的形成中起到重要作用。自噬是細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)成分被溶酶體降解的過程,廣泛存在于真核細(xì)胞中,在正常生長(zhǎng)條件下生物體可通過基礎(chǔ)自噬來(lái)維持蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等的更新,為生命活動(dòng)提供能量,對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起到重要作用。腫瘤細(xì)胞中的自噬是一把雙刃劍,一方面,自噬通過降解具有促進(jìn)腫瘤形成作用的特殊蛋白或降解受損細(xì)胞器來(lái)減輕這些因素對(duì)細(xì)胞的不良刺激,最終防止基因組損傷來(lái)抑制癌癥發(fā)生。另一方面,在腫瘤生長(zhǎng)的后期,自噬降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)及能量,以利于腫瘤細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏和低氧環(huán)境中生長(zhǎng)。所以在腫瘤進(jìn)展的不同階段,自噬所扮演的角色也有很大不同。研究目的和意義由于細(xì)胞存在維持基因組穩(wěn)定的機(jī)制,單獨(dú)的癌基因Ras的激活并不能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,僅能使細(xì)胞發(fā)生衰老,這也是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制,使機(jī)體發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的幾率降低。目前發(fā)現(xiàn)在癌基因Ras過度表達(dá)或激活后,自噬活性在癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞均上調(diào),并產(chǎn)生抑癌作用。然而,癌癥前體細(xì)胞是如何克服這些保護(hù)機(jī)制發(fā)生癌變,尚不明確。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯吭谌祟惓衫w維細(xì)胞過度表達(dá)H-Ras后細(xì)胞自噬活性,并且研究自噬抑制程度不同對(duì)細(xì)胞的影響。以期探討自噬調(diào)控在癌癥形成機(jī)制中的可能作用。實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞衰老的p半乳糖苷酶(β-Gal)染色將六孔板中的細(xì)胞,吸去細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS洗滌1次,加入1mL μ-GaL染色固定液(0.5%戊二醛在PBS中),室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液,用含2mM MgCL2的PBS洗滌細(xì)胞3次,吸去PBS,每孔加入1 mLβ-半乳糖苷酶染色工作液。37℃孵育2-4 h,最多12-16 h。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù),并計(jì)算被染上藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)目的百分比。2.生長(zhǎng)曲線檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)取經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染并用適當(dāng)?shù)乃幬锖Y選4天后的對(duì)照組WH細(xì)胞、過度表達(dá)Ras組細(xì)胞、分別經(jīng)10 nM雷帕霉素或者10μM氯喹處理的對(duì)照組WH細(xì)胞和過度表達(dá)Ras組的細(xì)胞。將感染后的第6天定義為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的第0天。將細(xì)胞按104個(gè)/孔種在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,平行種3孔,每4天計(jì)數(shù)一次后,細(xì)胞仍以104個(gè)/孔種回到新的細(xì)胞培養(yǎng)板中,總共連續(xù)計(jì)數(shù)3次,共計(jì)數(shù)12天。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸,細(xì)胞倍增數(shù)(Population doublings, PD)為縱軸,繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞倍增值PD的計(jì)算公式：PD=log(N2/N1)/log2。N1是種植的細(xì)胞數(shù),N2是長(zhǎng)到第4天的細(xì)胞數(shù)。3. Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)的變化將細(xì)胞裂解于裂解液中,在冰上超聲30 s后,4℃、12000 g高速離心15min,收集細(xì)胞上清,用Bradford法分析定量。上樣于凝膠上,再轉(zhuǎn)到尼龍纖維膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜,加入一抗(p62,LC3, p16INK4A, Phospho-p53(Ser15), Ha-Ras (C-20), ATG 7、β-actin)于4℃孵育過夜。在室溫加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗孵育1h。洗膜后加入顯色液,采用Kodak膠片曝光。4. siRNA介導(dǎo)自噬相關(guān)基因表達(dá)降低后衰老和蛋白的變化使用HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑,將Atg7、Atg5 siRNA分別轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞,培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞,Western blot檢測(cè)細(xì)胞Ras、p16、LC3、p62等蛋白表達(dá)。5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取對(duì)照組細(xì)胞WH、過度表達(dá)Ras組細(xì)胞、經(jīng)10nM的雷帕霉素或者10μM的氯喹處理的對(duì)照組細(xì)胞WH和過度表達(dá)Ras組細(xì)胞。收集細(xì)胞PBS洗一次,棄去上清,使用1×Binding buffer 100μl重懸細(xì)胞,加入5μl AnnexinV和5μlPI試劑溫和混勻,室溫避光孵育15 min后再加入300μl 1×Bing buffer,1h內(nèi)避光進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。6. Hochest和PI染色收集細(xì)胞,加入終濃度為1μg/ml的Hoechst33342和終濃度為1μg/ml的PI染料,室溫避光孵育10-15 min,熒光顯微鏡下使用紫色和藍(lán)色激發(fā)光觀察,計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞死亡率以PI陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞百分率表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.癌基因Ras過度表達(dá)誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞衰老從β-半乳糖苷酶染色結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn),過度表達(dá)Ras組細(xì)胞的藍(lán)染數(shù)目明顯多于對(duì)照組WH細(xì)胞,說明過度表達(dá)Ras后,細(xì)胞出現(xiàn)衰老。細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示,對(duì)照組WH細(xì)胞呈指數(shù)倍增,而過度表達(dá)Ras組細(xì)胞生長(zhǎng)停滯,并逐漸出現(xiàn)細(xì)胞負(fù)增長(zhǎng)。使用Western blot進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示過度表達(dá)Ras組細(xì)胞的p16、pp53蛋白明顯高于對(duì)照組WH細(xì)胞。2.癌基因Ras過度表達(dá)抑制人成纖維細(xì)胞自噬Western blot結(jié)果顯示,陽(yáng)性組Ras細(xì)胞的LC3、p62蛋白均明顯高于對(duì)照組WH細(xì)胞,說明過度表達(dá)Ras蛋白后細(xì)胞自噬被抑制,且細(xì)胞在自噬后期被抑制。加入自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素后,LC3和p62蛋白水平均明顯降低,表明過度表達(dá)Ras后細(xì)胞的自噬確實(shí)被抑制。3. 自噬抑制劑氯喹能增加細(xì)胞衰老使用自噬抑制劑氯喹作用細(xì)胞后,行p-半乳糖苷酶染色。Ras組細(xì)胞加氯喹后細(xì)胞藍(lán)染數(shù)目明顯多于未經(jīng)處理的Ras組細(xì)胞。生長(zhǎng)曲線結(jié)果也顯示Ras組細(xì)胞加氯喹后,細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線負(fù)增長(zhǎng)趨勢(shì)更加明顯,且Western blot結(jié)果顯示隨氯喹作用時(shí)間增加,細(xì)胞p16、pp53表達(dá)明顯增加。而對(duì)照組WH細(xì)胞p16和pp53表達(dá)少量增加,但細(xì)胞p-半乳糖苷酶染色和生長(zhǎng)曲線變化不明顯。4. 自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素減輕細(xì)胞的衰老程度使用雷帕霉素作用細(xì)胞后,p-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示,過度表達(dá)Ras組細(xì)胞加雷帕霉素后,細(xì)胞的藍(lán)染數(shù)目顯著降低,而對(duì)照組WH細(xì)胞加雷帕霉素后細(xì)胞藍(lán)染數(shù)目無(wú)變化。生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示過度表達(dá)Ras組細(xì)胞加雷帕霉素后,細(xì)胞的負(fù)增長(zhǎng)趨勢(shì)稍有緩和。且Western blot結(jié)果,隨雷帕霉素作用時(shí)間增加,蛋白p16、pp53水平均降低。5.抑制ATG7、ATG5的表達(dá)使過度表達(dá)癌基因Ras的人成纖維細(xì)胞衰老程度增加使用RNA干擾,抑制ATG7、ATG5的表達(dá),可阻斷自噬體的形成,抑制自噬的早期階段,可以發(fā)現(xiàn)使用RNA干擾后,細(xì)胞的ATG7、ATG5的表達(dá)明顯下降,過度表達(dá)Ras組細(xì)胞p62出現(xiàn)明顯累積,p16、pp53蛋白明顯升高,而在對(duì)照組WH細(xì)胞中這些變化均不明顯。6.氯喹和雷帕霉素處理改變Ras過度表達(dá)細(xì)胞的凋亡率細(xì)胞周期結(jié)果顯示,氯喹處理細(xì)胞后,過度表達(dá)Ras組細(xì)胞subG1期比例迅速升高,并且明顯高于未經(jīng)處理的過度表達(dá)Ras組細(xì)胞,雷帕霉素處理細(xì)胞后,過度表達(dá)Ras組細(xì)胞subGl期也顯著升高,但很快降低,在第3天后與未經(jīng)處理的過度表達(dá)Ras組細(xì)胞無(wú)差異。Hochest和PI染色結(jié)果顯示,氯喹處理的過度表達(dá)Ras組細(xì)胞PI陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加,雷帕霉素處理的過度表達(dá)Ras組細(xì)胞PI陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,以上結(jié)果在對(duì)照組細(xì)胞的變化均不明顯。結(jié)論1.癌基因H-Ras過度表達(dá)能誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞衰老；2.癌基因H-Ras過度表達(dá)抑制人成纖維細(xì)胞自噬；3.氯喹或降低自噬關(guān)鍵基因表達(dá)來(lái)抑制自噬,可加重過度表達(dá)癌基因H-Ras的人成纖維細(xì)胞的衰老；4.使用雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,能減輕過度表達(dá)癌基因H-Ras的人成纖維細(xì)胞的衰老。以上結(jié)果提示出H-Ras對(duì)自噬抑制的精確調(diào)控可能是Ras過度表達(dá)后通過瓶頸效應(yīng)誘導(dǎo)腫瘤形成的機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：自噬 癌基因 H-Ras 早衰 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-26
• 第一章 癌基因H-Ras誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和抑制細(xì)胞自噬26-47
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備26-29
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法29-36
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-43
• 1.4 討論43-46
• 1.5 結(jié)論46-47
• 第二章 改變自噬活性對(duì)H-Ras誘導(dǎo)的衰老程度的影響47-65
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備47-49
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法49-52
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-62
• 2.4 討論62-64
• 2.5 結(jié)論64-65
• 全文總結(jié)65-68
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 論文發(fā)表情況74-75
• 致謝75-76

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李錦;白雪源;崔少遠(yuǎn);傅博;陳香美;;雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞自噬抑制、氧化損傷和衰老的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年04期

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本文編號(hào)：644434