本文關(guān)鍵詞：B7-H4的異常表達(dá)在肝內(nèi)膽管癌發(fā)病機(jī)制中的作用研究

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【摘要】：[背景與目的]肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(ICC)分屬腺癌,區(qū)別于肝門部膽管癌,其來源于二級(jí)膽管及其分支的上皮組織。近年來,多項(xiàng)研究提示其細(xì)胞表面標(biāo)志物及其他生物學(xué)特征與肝門部膽管癌明顯不同。ICC是常見的肝臟原發(fā)性惡性腫瘤之一,ICC約占肝臟原發(fā)惡性腫瘤的10%-15%。發(fā)病率為肝臟原發(fā)惡性腫瘤的第2位,近年來其發(fā)病率逐年呈上升趨向。ICC早期無明顯臨床癥狀,癥狀隱匿,早期難以發(fā)現(xiàn),多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)己失去手術(shù)時(shí)機(jī),因此對(duì)ICC的早期診斷和及時(shí)治療提出了更高的要求。B7-H4是最近發(fā)現(xiàn)的協(xié)同刺激因子B7家族新成員,研究表明,B7-H4在一些腫瘤組織上高表達(dá),并與臨床分期和病理分級(jí)相關(guān)。本課題擬重點(diǎn)研究B7-H4介導(dǎo)ICC細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化發(fā)展的病理學(xué)機(jī)制,探討B(tài)7-H4是否直接影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性,從而進(jìn)一步闡明B7-H4在ICC病理過程中的作用,為臨床ICC靶向治療提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。[方法]組織層面：1.利用B7-H4抗體通過免疫組化技術(shù)分析B7-H4及其可能的通路分子在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)。2.WB法檢測(cè)癌組織及癌旁組織中的B7-H4表達(dá)。細(xì)胞層面篩選篩選B7-H4高表達(dá)的ICC細(xì)胞系……QBC939、RBE轉(zhuǎn)染慢病毒(shRNA-B7-H4)轉(zhuǎn)染ICC細(xì)胞系QBC939、RBE,用RT-PCR及WB、細(xì)胞免疫熒光法驗(yàn)證B7-H4 mRNA及蛋白的表達(dá)情況。細(xì)胞功能試驗(yàn)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)：顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化2.細(xì)胞功能學(xué)改變：2.1：CCK-8法測(cè)細(xì)胞增殖成長(zhǎng)變化；2.2：劃痕愈合試驗(yàn)測(cè)查細(xì)胞遷移能力變化,Transwell法試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力改變；2.3：WB法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后的B7-H4及E-cad、Snail、Vimentin、Erk1/2、AKT等)細(xì)胞信號(hào)分子的改變；2.4：流式細(xì)胞術(shù)——Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;2.5：細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)分子(如E-cad、Snail、Vimentin、Erkl/2、AKT等)的改變。[結(jié)果]1.B7-H4在ICC組織(或細(xì)胞系)中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(或細(xì)胞系)且其高表達(dá)的分度與腫瘤病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。2.設(shè)計(jì)合成的shRNA-B7-H4三條序列中有兩條可顯著抑制B7-H4基因的表達(dá)。3.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：3.1經(jīng)shRNA介導(dǎo)B7-H4表達(dá)沉默后,QBC939、RBE細(xì)胞連接緊密、折光性減弱、偽足明顯減少。伴上皮表型標(biāo)記分子E-cad表達(dá)上調(diào),間質(zhì)表型標(biāo)記分子Vimentin表達(dá)下調(diào),提示B7-H4可參與ICC細(xì)胞形態(tài)改變。3.2 B7-H4轉(zhuǎn)染后的ICC細(xì)胞在細(xì)胞增殖、劃痕遷移及Transwell侵襲能力減弱,凋亡增加。3.3 B7-H4轉(zhuǎn)染后的ICC細(xì)胞Caspases 3 (active)、Bax表達(dá)上調(diào)(凋亡促進(jìn)因子),Bcl-2表達(dá)則下調(diào),其在細(xì)胞凋亡過程中主要起抑制作用,并伴有Erkl/2磷酸化程度的下降。[結(jié)論]B7-H4在ICC中呈現(xiàn)高表達(dá),與腫瘤分期、病理分級(jí)及淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),提示該分子可能參與ICC病理進(jìn)程。ICC靶向慢病毒抑制(shRNA-B7H4)參與了肝內(nèi)膽管上皮的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,即EMT過程。同時(shí)也可促使Caspases-3、Bc1-2等的激活,并抑制Bax的表達(dá)及Erk1/2的磷酸化,同時(shí)促使ICC細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果均提示其在ICC發(fā)病中的作用。B7-H4的高表達(dá)參與了ICC的病理進(jìn)程,靶向B7-H4抑制可在一定程度上影響ICC細(xì)胞的生物學(xué)行為,有望成為ICC新的潛在治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：B7-H4 肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌 上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 凋亡 通路
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.8
【目錄】：

• 縮略詞表(以字母順序排列)5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 B7-H4在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)特征17-29
• 材料與方法17-24
• 結(jié)果24-27
• 討論27-28
• 結(jié)論28-29
• 第二部分 B7-H4增強(qiáng)ICC細(xì)胞致瘤性及其分子通路29-44
• 材料與方法29-34
• 結(jié)果34-43
• 討論43-44
• 結(jié)論44
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 綜述51-59
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果59-60
• 致謝60-61

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