發(fā)布時間：2017-08-07 06:04

  本文關(guān)鍵詞：Per2節(jié)律基因?qū)549肺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響及其相關(guān)分子的實驗研究

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【摘要】：研究背景肺癌是當(dāng)今世界發(fā)病率和病死率增長最快,對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標(biāo)志和特征,也是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的首要原因,約有30%的肺癌患者在首診時已有遠處轉(zhuǎn)移,另有50%-60%在治療過程中發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,80%-90%的肺癌死亡是由轉(zhuǎn)移引起。而近年來時間生物學(xué)(Chronobiology)在肺癌研究領(lǐng)域的運用為我們揭示肺癌轉(zhuǎn)移的分子機制這一難題開辟新思路。生物鐘基因不僅參與調(diào)控正常細(xì)胞的各種生物學(xué)行為,同樣也影響著腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為,可能是一種腫瘤抑制基因。近年來生物鐘基因特別是Period基因已成為國內(nèi)外肺癌研究領(lǐng)域內(nèi)的一個新焦點[3-5]。研究提示Period基因參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)行為。目前已知可能抑制肺癌轉(zhuǎn)移的基因有CDH1,Nm23,KAI1和MTS1等�？赡芷鸫龠M肺癌轉(zhuǎn)移作用的基因有c-Myc,VEGF和CD44。但對于Period基因是否參與了對肺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控,國內(nèi)外目前還沒有相關(guān)研究。目的探尋Per2基因在人肺癌中侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用和意義。方法體外實驗構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1(+)-Per2,慢病毒包裝,并采用慢病毒轉(zhuǎn)染人A549肺癌細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞株,RT-PCR和Western Blotting法鑒定過表達Per2基因表達。改良Boyden小室法和劃痕實驗法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外侵襲遷移能力的變化。RT-PCR和Western Blotting法檢測NM23、VEGF、C-MYC、CDH1和CD44基因和蛋白的表達水平。體內(nèi)實驗：運用免疫組化技術(shù)檢測皮下移植瘤中Per2,Nm23和CDH1的表達水平。通過裸鼠尾靜脈注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,構(gòu)建裸鼠A549肺癌細(xì)胞侵襲遷移模型,解剖兩組裸鼠的腦、肺、肝和腎上腺組織,進行HE染色,進行統(tǒng)計分析。結(jié)果體外實驗：RT-PCR實驗結(jié)果證實OE(over-expressed)組比NC(negative control)組Per2基因表達量高出11倍。Western blotting結(jié)果也顯示OE組較NC組Per2基因表達量明顯提高,并通過灰度定量分析,兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0425)。體外侵襲和遷移實驗結(jié)果表明NC組細(xì)胞穿透小室的平均細(xì)胞數(shù)為134.2±7.165和130.8±9.987。OE組細(xì)胞穿透小室的平均細(xì)胞數(shù)為56.80±6.763和20.20±4.164,NC組明顯高于OE組(P0.0001和P0.0001)。 劃痕實驗NC基因組細(xì)胞平均遷移距離為452.8±5.279像素,OE細(xì)胞平均遷移距離315.4±5.743像素,兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.0001)。RT-PCR和Western blotting結(jié)果也表明OE組細(xì)胞的VEGF、CD44和c-Myc基因的表達和蛋白水平明顯低于NC組,CDH1和Nm23的表達水平明顯增高(P值均小于0.05)。體內(nèi)實驗：皮下移植瘤免疫組化發(fā)現(xiàn)：OE組中Nm23和CDH1的表達水平高于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0383和0.0232)。結(jié)論Per2基因明顯降低了A549腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力。Per2基因通過調(diào)節(jié)與腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因來抑制A549腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力。其中,Per2基因下調(diào)A549細(xì)胞中的促腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因,如VEGF、CD44和c-Myc基因的表達水平,上調(diào)抑腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因,如Nm23和CDH1。本實驗為深入研究Per2基因影響肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制和信號通路奠定基礎(chǔ),具有重要的理論意義,并可為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的診斷與治療開辟新的思路。
【關(guān)鍵詞】：節(jié)律基因 Per2 肺癌 侵襲轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 個人簡歷3-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-10
• 第一部分 過表達Per2基因慢病毒的構(gòu)建包裝及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞10-34
• 1.實驗材料10-13
• 2.實驗方法13-28
• 3.28-34
• 第二部分 Per2基因?qū)549細(xì)胞體外侵襲遷移的影響及相34-42
• 1.實驗材料34-35
• 2.實驗方法35-37
• 3.結(jié)果37-42
• 第三部分 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞株的體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型42-49
• 1.實驗材料42-43
• 2.實驗方法43-45
• 3.結(jié)果45-49
• 討論49-52
• 結(jié)論52
• 參考文獻52-54
• 綜述54-65
• 參考文獻60-65
• 致謝65

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本文編號：633085