本文關(guān)鍵詞：短肽GMBP1通過GRP78逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥的分子機制

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【摘要】：【背景】胃癌發(fā)病率居世界惡性腫瘤第四位,死亡率居第二位,嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命[1]。化療是進(jìn)展期胃癌治療的主要手段之一,然而多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)現(xiàn)象的產(chǎn)生大大降低了化療效果,目前已知的許多MDR相關(guān)分子機制仍不能完全解釋胃癌MDR現(xiàn)象。因此,進(jìn)一步探索MDR分子機制,尋找新的胃癌耐藥相關(guān)分子及信號通路對逆轉(zhuǎn)胃癌MDR具有重要意義。本課題組利用噬菌體表面展示肽庫技術(shù)(phage display techniques),以胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR為陽性細(xì)胞,以結(jié)合能力為標(biāo)準(zhǔn),采用生物淘選(biopanning)的方法,并通過藥物敏感實驗進(jìn)行功能學(xué)篩選,獲得了能夠特異結(jié)合于胃癌耐藥細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)胃癌MDR表型的系列短肽BMBPs(Gastric Multidrug-resistant Binding Peptides,BMBPs)。GMBP1是其中的一種,它能與多種胃癌耐藥細(xì)胞特異性結(jié)合,具有逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥的活性,并通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)一步篩選并鑒定GMBP1結(jié)合受體為GRP78,研究發(fā)現(xiàn)GMBP1與GRP78結(jié)合后能夠發(fā)生內(nèi)化,但GMBP1與GRP78結(jié)合是否引起信號通路的活化或抑制,它是如何發(fā)生內(nèi)化、內(nèi)化后的亞細(xì)胞定位、是否激活新的信號通路,這些機制尚不清楚。因此,本課題擬通過流式細(xì)胞技術(shù)、si RNA技術(shù)及激光共聚焦顯微鏡等方法,研究GMBP1細(xì)胞內(nèi)化的亞細(xì)胞定位及其機制;采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)方法分析GRP78介導(dǎo)GMBP1逆轉(zhuǎn)耐藥的關(guān)鍵分子。本研究旨在闡明GMBP1逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥的分子機制,有望為胃癌耐藥逆轉(zhuǎn)治療提供新方法�！灸康摹�1.鑒定GMBP1及其受體GRP78亞細(xì)胞定位及GMBP1內(nèi)化入細(xì)胞的機制。2.闡明GMBP1通過GRP78逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥的分子機制,為胃癌耐藥逆轉(zhuǎn)治療提供實驗依據(jù)及可能的候選分子�！痉椒ā�1.通過免疫熒光和流式細(xì)胞技術(shù)分析短肽GMBP1及其受體GRP78在胃癌耐藥細(xì)胞的結(jié)合靶點亞細(xì)胞定位。2.通過si RNA技術(shù)建立低表達(dá)GRP78的胃癌細(xì)胞系(si GRP78-SGC7901/ADR和si GRP78-SGC7901/VCR),利用Western blot和RT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。3.通過免疫熒光技術(shù)驗證短肽GMBP1進(jìn)入胃癌耐藥細(xì)胞是否是其受體GRP78介導(dǎo)引起的內(nèi)化。4.選取經(jīng)典的發(fā)生細(xì)胞內(nèi)化的相關(guān)分子轉(zhuǎn)鐵蛋白,用熒光素標(biāo)記,通過激光共聚焦分析與FITC-GMBP1共定位情況,揭示其內(nèi)化途徑。選取針對轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)化途徑的特異性抑制劑氯丙嗪,通過免疫熒光實驗觀察短肽FITC-GMBP1的內(nèi)化能否被抑制,進(jìn)一步證實短肽是通過該途徑發(fā)生的內(nèi)化。5.采用同位素標(biāo)記差異蛋白定量分析(i TRAQ)技術(shù),對短肽GMBP1作用胃癌耐藥細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行篩選。6.對篩選出來的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,即GO分類分析和KEGG信號通路分析,預(yù)測差異蛋白所參與的信號通路。7.通過Western blot技術(shù)驗證篩選獲得的差異蛋白在GMBP1作用前后耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況。8.通過Western blot技術(shù)檢測短肽GMBP1作用耐藥細(xì)胞后差異蛋白、受體GRP78、耐藥和凋亡相關(guān)分子的表達(dá)情況,初步分析GMBP1及其受體在胃癌多藥耐藥中的作用機制,為胃癌耐藥逆轉(zhuǎn)治療提供新方法�！窘Y(jié)果】1.短肽GMBP1內(nèi)化入耐藥細(xì)胞的機制1)免疫熒光實驗結(jié)果證實,GRP78定位于耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR胞膜和核周胞漿。2)流式細(xì)胞結(jié)果顯示,FITC-GMBP1與耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR結(jié)合后的平均熒光強度高于對照肽FITC-URP,這表明GMBP1與其受體結(jié)合后可內(nèi)化入耐藥細(xì)胞。3)Western blot和RT-PCR結(jié)果證明,GRP78特異性小干擾RNA轉(zhuǎn)染后可有效降低胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中GRP78蛋白和m RNA的表達(dá)(P0.01)。4)免疫熒光實驗結(jié)果顯示,特異性下調(diào)GRP78表達(dá)后,FITC-GMBP1在耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR內(nèi)的熒光強度較對照組明顯減弱,初步證實短肽GMBP1進(jìn)入細(xì)胞是其受體GRP78介導(dǎo)的內(nèi)化。5)激光共聚焦實驗結(jié)果顯示,FITC-GMBP1(綠色熒光)與Alexa Fluor(AF)-594(紅色熒光)標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白共定位于胞漿內(nèi)(黃色熒光),氯丙嗪抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白功能后,FITC-GMBP1內(nèi)化熒光明顯減弱,證實GRP78介導(dǎo)短肽GMBP1內(nèi)化入耐藥細(xì)胞可能是通過轉(zhuǎn)鐵蛋白途徑發(fā)生的。2.短肽GMBP1作用耐藥細(xì)胞后差異表達(dá)蛋白的篩選1)對短肽GMBP1作用前后兩個胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR后的蛋白進(jìn)行i TRAQ篩選,在GMBP1作用后,SGC7901/ADR共鑒定出3752個蛋白,SGC7901/VCR共鑒定出3749個蛋白質(zhì)。將GMBP1作用后的蛋白表達(dá)差異倍數(shù)小于0.8倍,p值小于0.05的蛋白定義為下調(diào)蛋白,蛋白表達(dá)差異倍數(shù)大于1.5倍,p值小于0.05的蛋白定義為上調(diào)蛋白,我們獲得了一組胃癌多藥耐藥相關(guān)蛋白。在GMBP1作用SGC7901/ADR細(xì)胞系后,發(fā)現(xiàn)共有95個上調(diào)蛋白和48個下調(diào)蛋白;在GMBP1作用SGC7901/VCR細(xì)胞系后,發(fā)現(xiàn)共有129個上調(diào)蛋白和88個下調(diào)蛋白。其中發(fā)現(xiàn)EIF4E和CTBP2在兩個細(xì)胞系共同下調(diào)。2)運用生物信息學(xué)技術(shù)對篩選得到的蛋白進(jìn)行GO分類分析和KEGG通路分析。GO分析從細(xì)胞成分(cellular components,CC)、生物學(xué)途徑(biological processes,BP)、分子功能(molecular functions,MF)三方面進(jìn)行注釋。KEGG分析顯示,短肽GMBP1作用于SGC7901/ADR細(xì)胞后差異蛋白參與了38條KEGG通路,短肽GMBP1作用于SGC7901/VCR細(xì)胞后差異蛋白參與了79條KEGG通路。我們對這些通路進(jìn)行富集分析,將前十條顯著富集的KEGG進(jìn)行整理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EIF4E和CTBP2在GMBP1作用于兩個細(xì)胞系后均下調(diào),并且發(fā)現(xiàn)CTBP2參與了Wnt信號通路,差異蛋白EIF4E是PI3K/Akt信號通路的下游分子。3.短肽GMBP1作用耐藥細(xì)胞后差異表達(dá)蛋白的鑒定及其在胃癌耐藥中的作用機制1)Western blot結(jié)果顯示,EIF4E和CTBP2在兩個胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR均高表(P0.01),GMBP1作用耐藥細(xì)胞后,EIF4E和CTBP2表達(dá)均下降,結(jié)果與i TRAQ結(jié)果一致。2)Western blot結(jié)果顯示,GMBP1作用耐藥細(xì)胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR后,GRP78、MDR1、Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低,而Bax的表達(dá)增高�！窘Y(jié)論】1.短肽GMBP1與其受體GRP78特異性結(jié)合后定位于胞漿及胞膜,GMBP1內(nèi)化入耐藥細(xì)胞是其受體GRP78介導(dǎo)、通過經(jīng)典的轉(zhuǎn)鐵蛋白途徑發(fā)生的。2.通過i TRAQ技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析,完成胃癌多藥耐藥相關(guān)蛋白高通量篩選,獲得一組GMBP1作用耐藥細(xì)胞后差異表達(dá)蛋白分子。其中,GMBP1作用SGC7901/ADR細(xì)胞系后,上調(diào)蛋白95個,下調(diào)蛋白48個;GMBP1作用SGC7901/VCR細(xì)胞系后,上調(diào)蛋白129個,下調(diào)蛋白88個。候選分子EIF4E和CTBP2在多種耐藥細(xì)胞中表達(dá)變化一致,可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。3.GMBP1作用耐藥細(xì)胞后,EIF4E、MDR1表達(dá)明顯降低,Bcl-2/Bax比值下降。因此推測,GMBP1與膜轉(zhuǎn)位GRP78結(jié)合,通過阻斷AKT/PI3K信號通路而下調(diào)EIF4E表達(dá),直接或間接降低MDR1的表達(dá)和Bcl-2/Bax的比例,從而逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥。其具體機制尚需進(jìn)一步深入研究。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 多藥耐藥 GMBP1短肽 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78 iTRAQ
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-41
• 第一部分GMBP1-GRP78復(fù)合物內(nèi)化入耐藥細(xì)胞及其機制研究41-59
• 引言41
• 1 材料41-44
• 1.1 細(xì)胞株41-42
• 1.2 主要試劑及儀器42-44
• 2 方法44-51
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)44-45
• 2.2 免疫熒光檢測GRP78在耐藥細(xì)胞的熒光定位45-46
• 2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測FITC-GMBP1與耐藥細(xì)胞的結(jié)合能力46
• 2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染46-47
• 2.5 細(xì)胞總蛋白樣品制備47
• 2.6 Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中GRP78蛋白質(zhì)的表達(dá)量47-48
• 2.7 RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中GRP78 m RNA的表達(dá)量48-50
• 2.8 免疫熒光觀察下調(diào)GRP78表達(dá)后GMBP1內(nèi)化入耐藥細(xì)胞的變化50
• 2.9 激光共聚焦觀察GMBP1內(nèi)化機制50
• 2.10 干預(yù)實驗50-51
• 2.11 統(tǒng)計學(xué)處理51
• 3 結(jié)果51-57
• 3.1 免疫熒光觀察GRP78在胃癌耐藥細(xì)胞的亞細(xì)胞定位51-52
• 3.2 流式細(xì)胞分析結(jié)果52-53
• 3.3 Western blot方法及RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染效率53-54
• 3.4 下調(diào)GRP78表達(dá)后短肽GMBP1內(nèi)化入耐藥細(xì)胞的變化54-55
• 3.5 激光共聚焦技術(shù)研究GMBP1內(nèi)化入細(xì)胞的機制55-57
• 4 討論57-59
• 第二部分 基于ITRAQ技術(shù)篩選GMBP1作用胃癌耐藥細(xì)胞后多藥耐藥相關(guān)蛋白59-71
• 引言59-60
• 1 材料60-61
• 1.1 細(xì)胞系60
• 1.2 主要試劑和耗材60
• 1.3 主要儀器設(shè)備60-61
• 2 方法61-63
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)61
• 2.2 i TRAQ蛋白質(zhì)提取和定量61-62
• 2.3 丙酮沉淀62
• 2.4 半胱氨酸封閉62
• 2.5 蛋白質(zhì)酶解62
• 2.6 i TRAQ試劑進(jìn)行標(biāo)記62-63
• 2.7 肽段分離和鑒定63
• 2.8 生物信息學(xué)分析63
• 3 結(jié)果63-68
• 3.1 差異蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)分析63-65
• 3.2 差異蛋白質(zhì)GO功能聚類分析65-67
• 3.3 差異蛋白質(zhì)的KEGG信號通路分析67-68
• 4 討論68-71
• 第三部分 初步探討GMBP1及其受體GRP78逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥的分子機制71-79
• 引言71
• 1 材料71-73
• 1.1 細(xì)胞株71
• 1.2 主要試劑及儀器71-73
• 2 方法73-74
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)73
• 2.2 Western blot蛋白質(zhì)提取和定量73
• 2.3 Western blot檢測差異蛋白的表達(dá)水平及耐藥和凋亡相關(guān)分子表達(dá)73-74
• 3 結(jié)果74-76
• 3.1 GMBP1作用耐藥細(xì)胞后差異蛋白EIF4E和CTBP2表達(dá)水平的鑒定74-75
• 3.2 GMBP1作用耐藥細(xì)胞后GRP78、MDR1及凋亡相關(guān)分子的表達(dá)情況 ..· 704 討論75-76
• 4 討論76-79
• 小結(jié)79-80
• 參考文獻(xiàn)80-94
• 附錄94-106
• 附錄 194-98
• 附錄 298-104
• 附錄 3104-105
• 附錄 4105-106
• 個人簡歷和研究成果106-108
• 致謝108

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李遠(yuǎn);向姣;張莎莎;劉北忠;龔放;彭明清;;微流控芯片技術(shù)分析細(xì)胞外酸性環(huán)境對腫瘤細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)、活性及其介導(dǎo)的道諾霉素細(xì)胞毒性的影響[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2015年01期

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本文編號：630087