本文關(guān)鍵詞：LncRNA h19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響

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【摘要】：目的:肺部惡性腫瘤是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快,對(duì)人群健康、生活和生命威害最大的惡性腫瘤之一。根據(jù)全國(guó)腫瘤登記中心2014年最新研究顯示,全國(guó)男性肺癌的發(fā)病率為(1/105)49.27,在所有惡性腫瘤中位居第一位;女性肺癌的發(fā)病率為21.66,在所有惡性腫瘤中位居第二(乳腺癌25.89)。在全國(guó)城市中肺癌的發(fā)病率和死亡率為20.48和27.05均位居第一位;與此同時(shí),在全國(guó)農(nóng)村中肺癌的發(fā)病率和死亡率為18.50和22.42也均位居第一位。隨著現(xiàn)在科技的進(jìn)步以及各為研究者的深入研究,雖然對(duì)于肺癌的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入,但是在肺癌的防治仍然是我們目前面臨的重大難題。好多肺癌患者在出現(xiàn)臨床癥狀的同時(shí)就醫(yī),大多數(shù)已處于中晚期,因此研究肺癌的發(fā)病機(jī)制,尋找肺癌的分子生物學(xué)早期診斷指標(biāo),探討肺癌的治療靶標(biāo),不僅是在臨床具有重要的價(jià)值,更重要的是對(duì)于社會(huì)更有積極的意義。肺部惡性腫瘤的從發(fā)生到發(fā)展是一個(gè)逐步積累的過(guò)程,一般是由于細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中調(diào)控紊亂及生長(zhǎng)方式的改變,從而引起細(xì)胞發(fā)生癌前病變及基因改變。肺癌的發(fā)生是一個(gè)積累性的基因損傷,是一個(gè)多步驟、多基因參與的過(guò)程,包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活、以及表觀調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平的紊亂,造成細(xì)胞組織器官失去原有的性質(zhì)及作用對(duì)于人體造成損傷。Lnc RNA是以RNA的形式在多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平,一般而言,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)lnc RNAs廣泛參與了基因組調(diào)節(jié),在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移方面起著重要的作用。雖然長(zhǎng)鏈非編碼RNA h19的異常表達(dá)與其他腫瘤的發(fā)生,包括肝癌、卵巢癌、前列腺癌、大腸癌、乳腺癌,有著密切的關(guān)系[1-7],但在非小細(xì)胞肺癌中的相關(guān)文獻(xiàn)尚不多見(jiàn)。因此,本研究旨在研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA h19在非小細(xì)胞肺癌中的異常表達(dá)對(duì)肺癌高危因素的相關(guān)性及對(duì)癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的影響。方法:⑴收集64例手術(shù)治療患者中,術(shù)前診斷為非小細(xì)胞肺癌并未接受放化療,術(shù)后病理確診為非小細(xì)胞肺癌的患者,切除的新鮮癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織;并將組織冰鹽水中清洗干凈并放入液氮中速凍24小時(shí)移至-80℃冰箱保存。⑵q RT-PCR檢測(cè)64例非小細(xì)胞肺癌中h19的表達(dá)情況:首先采用Trizol法提取癌組織及正常組織的總RNA;然后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA質(zhì)量鑒定,確保RNA的完整性;再次設(shè)計(jì)lnc RNA h19的反轉(zhuǎn)錄引物以及相應(yīng)的上、下游引物,并且根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;最后應(yīng)用q RT-PCR檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA h19的表達(dá)情況。⑶根據(jù)各組的表達(dá)情況分析其與肺癌高危因素的相關(guān)性。⑷選取肺癌細(xì)胞株A549進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。⑸應(yīng)用TRIZE方法提取非編碼長(zhǎng)鏈RNA;利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定;設(shè)計(jì)lnc RNA h19的反轉(zhuǎn)錄引物以及相應(yīng)的上、下游引物,根據(jù)h19基因β-actin基因[8]使用引物設(shè)計(jì)軟件primerprimer5,分別參照Gene Bank所刊登序列設(shè)計(jì),以內(nèi)參基因β-actin基因作為對(duì)照;再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,q RT-PCR來(lái)測(cè)定細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)h19的情況。⑹構(gòu)建過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒載體:p CDNA3.1-lnc RNA h19;首先根據(jù)上述方法設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,鑒定成功后構(gòu)建真核表達(dá)載體p CDNA3.1-lnc RNA h19,構(gòu)建完成后使用雙酶切以及瓊脂糖凝膠電泳再次進(jìn)行確定目的基因的真實(shí)性。⑺G418篩選穩(wěn)定表達(dá)A549細(xì)胞系:首先確定抗生素G418篩選濃度,然后篩選出較穩(wěn)定并且過(guò)表達(dá)lnc RNAh19的細(xì)胞株A549-p CDNA3.1-lnc RNAh19,并使用real-time PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)目的基因表達(dá)水平,以確定細(xì)胞株是否已經(jīng)建立成功。⑻對(duì)于過(guò)表達(dá)的A549-p CDNA3.1-lnc RNAh19細(xì)胞株通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力,并設(shè)置陰性對(duì)照組(只轉(zhuǎn)染空載體),設(shè)置空白對(duì)照組(加入轉(zhuǎn)染試劑)。⑼對(duì)于過(guò)表達(dá)的A549-p CDNA3.1-lnc RNAh19細(xì)胞株通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,并以轉(zhuǎn)染空載體的陰性對(duì)照組及僅加入轉(zhuǎn)染試劑的空白對(duì)照組作為對(duì)比。⑽對(duì)于過(guò)表達(dá)的A549-p CDNA3.1-lnc RNA h19細(xì)胞株通過(guò)transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力,并設(shè)置陰性對(duì)照組(只轉(zhuǎn)染空載體),設(shè)置空白對(duì)照組(加入轉(zhuǎn)染試劑)。結(jié)果:⑴lnc RNA h19在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P0.05)⑵lnc RNA h19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05)而與年齡、性別、有無(wú)吸煙史及腫瘤類型無(wú)相關(guān)性。⑶過(guò)表達(dá)lnc RNA h19導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖能力增加。結(jié)論:⑴lnc RNA h19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯高于正常肺組織,提示其與腫瘤的發(fā)生有很大的關(guān)系,并且可能發(fā)生促癌基因的作用。⑵lnc RNA h19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性,與年齡、性別、有無(wú)吸煙史及腫瘤類型無(wú)相關(guān)性,提示lnc RNA h19表達(dá)增高的腫瘤組織易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。⑶過(guò)表達(dá)lnc RNA h19導(dǎo)致細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖性增加,提示lnc RNA h19可能成為治療非小細(xì)胞肺癌的新的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：非小細(xì)胞肺癌 非編碼長(zhǎng)鏈RNA h19 遷移 侵襲 增殖
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫(xiě)11-12
• 前言12
• 材料與方法12-24
• 結(jié)果24-27
• 附圖27-33
• 附表33-34
• 討論34-36
• 結(jié)論36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 綜述 lncRNA在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展39-49
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 致謝49-50
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷50

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 熊偉民;李明峰;宋佳鴻;岳海燕;席素娟;李朝燕;;長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年10期

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本文編號(hào)：626747