本文關(guān)鍵詞：PITX2、β-catenin在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及意義

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【摘要】：卵巢上皮性癌是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一,死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首。卵巢深居盆腔,卵巢上皮性癌起病比較隱匿,由于缺乏早期診斷方法,70%~80%已屬晚期,極易發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散,然而即使完善的腫瘤減滅術(shù)之后,病人的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍很高,五年存活率仍徘徊在30%-40%左右。卵巢上皮性癌已成為嚴(yán)重威脅婦女生命的惡性腫瘤。PITX2全稱為“垂體同型框2”(pituitary homeobox 2),定位于染色體4q25-26,是同型框基因bicoid相關(guān)家族的一員,因最初發(fā)現(xiàn)在垂體發(fā)育中發(fā)揮作用而得名,在脊椎動(dòng)物的垂體、大腦、心臟、牙齒等發(fā)育過程中起到重要作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn),PITX2基因突變可能與多種疾病有關(guān),如:里格爾綜合征(axenfeld-Riegersyndrome)、虹膜發(fā)育不全(iridogoniodysgenesis syndrome)和零星彼得綜合征(sporadic Peter syndrome)等,但是越來越多的資料表明PITX2的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),例如:大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、甲狀腺瘤等。既往大量研究顯示W(wǎng)nt信號(hào)通路在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。2002年Kioussi等在垂體腺瘤中研究表明當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活時(shí),Wnt蛋白與細(xì)胞表面Fz受體以及共同受體結(jié)合后,從而抑制β-catenin-Axin-APC-GSK-3β復(fù)合物的形成,使GSK-3β失活,β-catenin不能被GSK-3β磷酸化而不被降解,逐漸積聚進(jìn)入細(xì)胞核,與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF相結(jié)合,啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的下游靶基因PITX2,從而促進(jìn)PITX2下游靶基因如C-myc、Cyclin D1、Cyclin D2等的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖或活化,最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。PITX2是Wnt信號(hào)通路的下游基因,并受Wnt/Dvl/β-catenin的調(diào)節(jié),但是在卵巢上皮性癌中PITX2異常激活是否與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)仍不清楚。目的本研究通過從組織水平和細(xì)胞水平上對(duì)PITX2和β-catenin進(jìn)行研究,探討PITX2與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系以及PITX2在卵巢上皮性癌中異常高表達(dá)是否受Wnt/β-catenin調(diào)控。材料和方法1.研究對(duì)象:1.1臨床標(biāo)本收集2012年9月-2014年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院、第一附屬醫(yī)院的手術(shù)標(biāo)本114例,患者年齡16歲到70歲,中位年齡54歲,根據(jù)組織的良惡程度將標(biāo)本分為3組:卵巢上皮性癌42例(惡性組);卵巢上皮性良性腫瘤37例(良性組),正常卵巢組織35例(正常組);組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋。42例卵巢上皮性癌患者、37例卵巢上皮良性腫瘤、35例非卵巢腫瘤患者血清標(biāo)本,采血時(shí)間均為早上6點(diǎn)到8點(diǎn),室溫下血液靜置20min,4℃下3000r/min離心20min,取上清置于EP管,-80℃冰箱保存。所有病例均未合并其他腫瘤病史,術(shù)前、術(shù)后均未接受放、化療,取材前均與患者及家屬溝通并獲得其知情同意,術(shù)后均經(jīng)病理科確診。1.2細(xì)胞株SKOV3、OVCAR3兩株細(xì)胞來自于美國(guó)ATCC,兩細(xì)胞株培養(yǎng)均使用1640培養(yǎng)基(含10%滅火胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素),在37.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期后分別加入Wnt通路抑制劑DKK130 ng/ml。細(xì)胞分組:SKOV3空白對(duì)照組、SKOV3+DKK1抑制劑組、OVCAR3空白對(duì)照組、OVCAR3+DKK1抑制劑組。2.研究方法:a.運(yùn)用免疫組織化學(xué)SP法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)方法分別檢測(cè)不同卵巢組織中PITX2和β-catenin蛋白和m RNA的表達(dá)。b.運(yùn)用Elisa法檢測(cè)不同卵巢疾病患者血清中PITX2蛋白的表達(dá)。c.運(yùn)用MTT法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3、OVCAR3兩株細(xì)胞在加入Wnt通路抑制劑DKK1前后細(xì)胞的增殖能力和遷移能力。d.運(yùn)用Q-PCR和Western bolt分別檢測(cè)SKOV3、OVCAR3兩株細(xì)胞在加入Wnt通路抑制劑DKK1前后PITX2和β-catenin蛋白和m RNA的表達(dá)。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)比較正常組、良性組、惡性組中PITX2和β-catenin蛋白的陽性表達(dá)率以及兩種蛋白在惡性組中與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。在正常組、良性組、惡性組中PITX2和β-catenin m RNA的表達(dá)水平采用單因素方差進(jìn)行分析,組與組之間兩兩比較采用LSD-t法。應(yīng)用Pearson列聯(lián)系數(shù)進(jìn)行分析在卵巢上皮性癌組織中PITX2和β-catenin蛋白表達(dá)的相關(guān)性。兩獨(dú)立樣本均數(shù)之間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)采用α=0.05,組間兩兩比較時(shí)檢驗(yàn)水準(zhǔn)采用α′=α/比較次數(shù)=0.0167。結(jié)果1.根據(jù)組織免疫化學(xué)染色結(jié)果PITX2蛋白陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)。PITX2蛋白在正常組中,良性組中以及惡性組中的陽性表達(dá)率分別為14.3%(5/35)、16.2%(6/37)、83.3%(35/42),其中惡性組中的陽性表達(dá)率明顯高于正常組和良性組(P0.0167),正常組與良性組相比無明顯差異(P0.0167)。2.卵巢上皮性癌組織中,PITX2蛋白表達(dá)與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織分化程度以及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05);與患者年齡無關(guān)(P0.05)。3.PITX2蛋白在正常組、良性組、惡性組患者血清中的表達(dá)量分別為7.25±2.24ng.m L-1、7.83±1.9ng.m L-1、12.18±2.38ng.m L-1,惡性組患者血清中PITX2蛋白的表達(dá)量明顯高于良性組和正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),正常組與良性組之間無明顯差異(P0.05)。4.PITX2 m RNA在正常組、良性組、惡性組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.128±0.087、0.167±0.106、0.405±0.126,惡性組中PITX2的m RNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常組和良性組(P0.001),但正常組與良性組之間無明顯差異(P0.05)。5.根據(jù)組織免疫化學(xué)染色結(jié)果β-catenin蛋白陽性異位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。β-catenin蛋白在正常組、良性組、惡性組中的陽性表達(dá)率分別為5.7%(2/35)、10.8%(4/37)、85.7%(36/42),惡性組中的陽性表達(dá)率明顯高于正常組和良性組(P0.0167),正常組與良性組相比無明顯差異(P0.0167)。6.卵巢上皮性癌組織中,β-catenin蛋白的異位表達(dá)與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織分化程度以及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05);與患者年齡無關(guān)(P0.05)。7.β-catenin m RNA在正常組、良性組、惡性組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.110±0.082、0.132±0.095、0.286±0.106,惡性組中β-catenin的m RNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常組和良性組(P0.001),但正常組與良性組之間無明顯差異(P0.05)。8.卵巢上皮性癌組織中,PITX2蛋白表達(dá)和β-catenin蛋白的異位表達(dá)具有相關(guān)性,并且兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系(rp=0.548,P=0.003)。9.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中當(dāng)在SKOV3、OVCAR3細(xì)胞株中分別加入Wnt通路抑制劑DKK1 30ng/ml時(shí),細(xì)胞增殖能力和遷移能力均下降(P0.05)。10.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中當(dāng)在SKOV3、OVCAR3細(xì)胞株中分別加入Wnt通路抑制劑DKK1 30ng/ml時(shí),PITX2、β-catenin m RNA和蛋白質(zhì)均下降(P0.05)。結(jié)論1.PITX2和β-catenin在卵巢上皮性癌中異常高表達(dá),并與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織分化程度以及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān),并且兩者呈正相關(guān),說明PITX2和β-catenin可能協(xié)同參與了卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展。2.PITX2蛋白在卵巢上皮性癌患者血清中高表達(dá),提示PITX2可能作為卵巢上皮性癌患者早期診斷、評(píng)估病情進(jìn)展的有效指標(biāo)。3.當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到抑制時(shí),PITX2表達(dá)量明顯下降,細(xì)胞的增殖能力和遷移能力均下降,說明PITX2可能做為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因,參與卵巢上皮性癌的發(fā)生及發(fā)展過程。
【關(guān)鍵詞】：卵巢上皮性癌 PITX2 β-catenin
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 摘要4-8
• abstract8-14
• 中英文縮略詞14-15
• 引言15-17
• 材料與方法17-31
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-37
• 討論37-43
• 結(jié)論43-44
• 附圖44-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 綜述 轉(zhuǎn)錄因子PITX2 的研究進(jìn)展54-70
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及在讀期間發(fā)表的論文70-71
• 致謝71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：626627