本文關(guān)鍵詞：p53缺失型HL-60白血病細胞中核干細胞因子下調(diào)對p73的影響

  更多相關(guān)文章： nucleostemin 非P53依賴性通路 慢病毒載體 △Np73 TAp73

【摘要】：目的:本課題組前期通過基因芯片技術(shù)闡明了抑制Nucleostemin表達后P53缺失型白血病細胞株HL-60全基因組表達譜改變情況,利用生物信息學(xué)篩選出了其中與NS下調(diào)變化最相關(guān)的幾條信號通路,其中PI3K/AKT/m TOR通路在基因和蛋白水平已被證實,后續(xù)的研究證明m TOR介導(dǎo)的自噬也可能參與其中,但目前的研究僅僅表明PI3K/AKT/m TOR通路與NS非P53依賴信號通路密切相關(guān),其上下游節(jié)點特別是上游節(jié)點并不清楚,P73作為P53家族的一員,結(jié)構(gòu)和功能與P53都很相似且其在腫瘤細胞中極少發(fā)生突變,被認為是一種潛在的抑癌基因,其是否有可能參與NS非P53依賴信號通路,目前未見文件記載。為了驗證P73是否參與NS非P53依賴信號通路,本研究探討了P53缺失型HL-60白血病細胞中核干細胞因子下調(diào)對P73的影響,從而為這一推論提供依據(jù)。方法:(1)用慢病毒載體NS-si RNA-GV248和其它兩種輔助包裝原件共同轉(zhuǎn)染293T細胞,進行病毒的包裝及滴度測定。(2)在96孔板上以不同MOI值(MOI=50,MOI=100,MOI=150)的慢病毒轉(zhuǎn)染HL-60細胞,每孔接種100μl培養(yǎng)液,細胞密度約為5×104,確定慢病毒感染HL-60細胞的合適MOI值。(3)確定合適MOI值后,用制備好的慢病毒載體轉(zhuǎn)染Hl-60細胞,通過熒光倒置顯微鏡、實時熒光定量PCR及Western Blot確定轉(zhuǎn)染效率和NS下調(diào)程度。(4)分別在0小時、48小時、72小時、96小時觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后陰性對照組和試驗組內(nèi)HL-60細胞△Np73、TAp73、NS在基因和蛋白水平上的表達情況。(5)對數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0軟件,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,多組樣本間的比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用Bonferroni法,校正檢驗水準(zhǔn)α=0.0167.結(jié)果:(1)將沉默NS基因的慢病毒載體NS-RNAi-GV248轉(zhuǎn)染293T細胞,在其胞內(nèi)進行包裝、濃縮,檢測病毒滴度為4×108TU/ml。(2)當(dāng)MOI值≥100時,倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率均達80%以上,MOI=100或150兩者相差不大,本次實驗選擇MOI=100。(3)Real-time PCR結(jié)果顯示:NS表達下調(diào)后,實驗組在0小時、48小時、72小時、96小時,△Np73基因表達量逐漸減低,TAp73基因表達量逐漸增加,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。(4)Western blot結(jié)果顯示:NS表達下調(diào)后,實驗組在0小時、48小時、72小時、96小時,△Np73蛋白表達量逐漸減低,TAp73蛋白表達量逐漸增加,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:(1)下調(diào)NS的表達使△Np73在基因和蛋白水平表達量減低,TAp73在基因和蛋白水平表達量增加,且與時間相關(guān)。(2)NS變化引起P73變化,提示P73可能參與了NS非P53依賴信號通路,從而為進一步研究NS非P53依賴性通路打下基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：nucleostemin 非P53依賴性通路 慢病毒載體 △Np73 TAp73
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7;R730.43
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 中英文縮略詞11-12
• 引言12-14
• 1 實驗材料14-19
• 1.1 細胞系14
• 1.2 引物序列14
• 1.3 載體14-15
• 1.4 主要試劑及耗材15-16
• 1.5 主要儀器16-17
• 1.6 主要試劑配制17-18
• 1.7 主要分析軟件18-19
• 2 實驗方法19-26
• 2.1 細胞培養(yǎng)19-20
• 2.2 細胞總RNA提取20
• 2.3 RNA濃度、純度檢測20-21
• 2.4 熒光定量PCR檢測21-22
• 2.5 重組慢病毒NS-RNAi-GV248感染HL-60細胞22-23
• 2.6 Real-time PCR測定不同目的基因的表達情況23-24
• 2.7 Western blot測定不同目的基因蛋白水平表達情況24-26
• 3 結(jié)果判斷26-28
• 3.1 Real-time PCR結(jié)果計算26
• 3.2 Western blot結(jié)果判斷26
• 3.3 統(tǒng)計學(xué)處理26-28
• 4 結(jié)果28-34
• 4.1 慢病毒載體感染HL-60細胞最適MOI值確定28
• 4.2 轉(zhuǎn)染六孔板培養(yǎng)的HL-60細胞28-29
• 4.3 Real-timePCR檢測不同時間點NS在基因水平上的表達情況29
• 4.4 Western blot檢測不同時間點NS在蛋白水平上的表達情況29-30
• 4.5 6 孔板培養(yǎng)HL-60細胞轉(zhuǎn)染不同時間點凋亡情況30-31
• 4.6 Real-timePCR檢測不同時間點TAp73和△Np73在基因水平的表達情況31-32
• 4.7 Western blot檢測不同時間點TAp73和△Np73在蛋白水平上的表達情況32-34
• 5 討論34-38
• 5.1 NS與P53、P73之間的關(guān)聯(lián)性34-36
• 5.2 NS與P73、MDM2之間的關(guān)聯(lián)性36-37
• 5.3 NS與P73、P21之間的關(guān)聯(lián)性37-38
• 6 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-44
• 綜述 核干細胞因子的研究進展44-64
• 參考文獻55-64
• 個人簡歷64-65
• 致謝65

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本文編號：613365