本文關(guān)鍵詞：胰腺癌Foxp3陽性腫瘤細(xì)胞對Treg趨化現(xiàn)象的研究

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【摘要】：目的胰腺癌是目前惡性程度較高的腫瘤之一,導(dǎo)管腺癌是其最常見的病理類型,約90%胰腺癌為胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma,PDAC),大約60%的胰腺癌患者在確定診斷時已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,25%患者為局部晚期,不能行根治性切除術(shù),中位生存期僅為6~9個月,不可手術(shù)切除的患者5年總體生存率不足5%。腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境有著密切關(guān)系,這個環(huán)境稱為腫瘤微環(huán)境,具體是指腫瘤局部浸潤的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及所分泌的活性介質(zhì)等與腫瘤細(xì)胞共同構(gòu)成的局部內(nèi)環(huán)境。免疫細(xì)胞做為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分,正日益受到人們的重視。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory cell,Treg)是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T細(xì)胞亞群,其在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用。Treg細(xì)胞特征性表達(dá)CD4+CD25+Foxp3+。另外轉(zhuǎn)錄因子Foxp3不僅能作為CD4+CD25+Treg的標(biāo)志分子,還是決定CD4+CD25+Treg功能的關(guān)鍵基因。結(jié)合文獻(xiàn)和我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌與正常胰腺組織相比,表達(dá)較高的Foxp3。而且我們發(fā)現(xiàn)在Foxp3表達(dá)較高的組織標(biāo)本中,Treg浸潤同樣較多。以上的發(fā)現(xiàn)使我們推測,導(dǎo)管腺癌細(xì)胞也許可以通過自身表達(dá)Foxp3,啟動某些基因的表達(dá),通過一些信號通路或事件,趨化血循環(huán)的Treg細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境中,發(fā)揮免疫抑制效應(yīng),介導(dǎo)病人的不良預(yù)后。本實驗作為Foxp3對Treg趨化現(xiàn)象和機(jī)制探究的前期研究基礎(chǔ),重點放在Foxp3的臨床意義,病人標(biāo)本中Foxp3對Treg的趨化現(xiàn)象,體外實驗Foxp3對Treg的趨化現(xiàn)象,以及構(gòu)建Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,為本課題組后續(xù)實驗打下堅實基礎(chǔ)。方法一、腫瘤細(xì)胞Foxp3的表達(dá)、Treg數(shù)與病人預(yù)后的關(guān)系,及其與腫瘤微環(huán)境中Treg浸潤的相關(guān)性1.利用免疫組化方法檢測正常胰腺組織和多種胰腺腫瘤組織Foxp3表達(dá),探討胰腺導(dǎo)管腺癌Foxp3表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系。2.利用免疫組化方法檢測導(dǎo)管腺癌腫瘤微環(huán)境中Treg浸潤情況,并分析其與病人預(yù)后的關(guān)系。3.利用Spearman相關(guān)性分析同一病人腫瘤組織Foxp3表達(dá)與周圍Treg浸潤是否有統(tǒng)計學(xué)聯(lián)系。二、人源Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒、人源Foxp3過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系、鼠源Foxp3干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立及驗證1.利用基因工程技術(shù),將人源Foxp3蛋白編碼區(qū)連接到瞬轉(zhuǎn)載體和慢病毒載體。2.利用Ca Cl2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生病毒液,并用三包裝體系感染目的細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。3.購買鼠源Sh Foxp3載體,利用三包裝體系感染鼠源胰腺癌細(xì)胞系,構(gòu)建穩(wěn)定敲除Foxp3的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。4.分別用Realtime PCR的方法和Western Blot檢測瞬轉(zhuǎn)及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的效果。三、體外胰腺癌細(xì)胞系對Treg細(xì)胞的趨化1.利用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,或瞬轉(zhuǎn)技術(shù)及小干擾RNA技術(shù),獲得胰腺癌細(xì)胞系過表達(dá)或干擾Foxp3的上清液。2.利用ficoll密度梯度離心法從新生兒臍帶血中,獲得數(shù)量較多的淋巴細(xì)胞,并用磁珠的方法,分離出CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞。3.利用Transwell小室,驗證各種不同的胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液對Treg的趨化作用。結(jié)果在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中,腫瘤細(xì)胞Foxp3的表達(dá)明顯增高,Foxp3的表達(dá)程度與病人標(biāo)本組織學(xué)分化有統(tǒng)計學(xué)聯(lián)系,而且Foxp3的表達(dá)程度與病人的總生存期和無復(fù)發(fā)生存亦存在統(tǒng)計學(xué)聯(lián)系。胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤微環(huán)境中存在Treg細(xì)胞的表達(dá),其表達(dá)量與病人的總生存期和無復(fù)發(fā)生存存在統(tǒng)計學(xué)聯(lián)系。利用Spearman相關(guān)性分析腫瘤組織中Foxp3的表達(dá)與周圍Treg浸潤存在相關(guān)性。通過測序分析,成功構(gòu)建Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒質(zhì)粒,利用Realtime PCR和Western Blot驗證瞬轉(zhuǎn)和構(gòu)建穩(wěn)系的效果,發(fā)現(xiàn)Foxp3可以明顯的上調(diào)或下調(diào),穩(wěn)系構(gòu)建成功,為本課題后續(xù)體外實驗和動物實驗奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)ficoll密度梯度離心及磁珠的方法,經(jīng)流式檢測,可以分離出的足量的Treg細(xì)胞保證后續(xù)實驗的使用。利用transwell趨化實驗證明,無論是瞬轉(zhuǎn)過表達(dá)質(zhì)粒還是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,過表達(dá)Foxp3的胰腺癌細(xì)胞上清培養(yǎng)液對Treg趨化作用明顯增強(qiáng),而干擾Foxp3的胰腺癌細(xì)胞上清培養(yǎng)液對Treg趨化作用明顯減弱。差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論胰腺導(dǎo)管腺癌高表達(dá)Foxp3,且與病人總生存期和無復(fù)發(fā)生存期相關(guān),Foxp3表達(dá)與Treg的浸潤存在統(tǒng)計聯(lián)系,提示腫瘤細(xì)胞Foxp3可能對Treg存在某種趨化作用。在構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,趨化實驗表明Foxp3對于純化出來的Treg確實存在趨化作用。
【關(guān)鍵詞】：胰腺導(dǎo)管腺癌 Foxp3 Treg 趨化
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-13
• 前言13-16
• 研究現(xiàn)狀、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、腫瘤細(xì)胞Foxp3表達(dá)與Treg浸潤間的關(guān)系16-26
• 1.1 對象和方法16-18
• 1.1.1 實驗對象16-17
• 1.1.2 實驗方法17-18
• 1.2 結(jié)果18-24
• 1.2.1 正常胰腺及不同胰腺腫瘤Foxp3的表達(dá)18-19
• 1.2.2 導(dǎo)管腺癌Foxp3表達(dá)情況及其與病人生存期相關(guān)性分析19-20
• 1.2.3 導(dǎo)管腺癌腫瘤微環(huán)境中Treg表達(dá)情況及其與病人生存期相關(guān)性分析20
• 1.2.4 導(dǎo)管腺癌Foxp3表達(dá)情況及其與臨床病理特征之間的聯(lián)系20-21
• 1.2.5 導(dǎo)管腺癌Foxp3表達(dá)情況及腫瘤微環(huán)境中Treg浸潤與病人預(yù)后的單因素及多因素分析21-22
• 1.2.6 導(dǎo)管腺癌Foxp3表達(dá)情況與腫瘤微環(huán)境中Treg浸潤相關(guān)性檢驗22-24
• 1.3 討論24-25
• 1.4 小結(jié)25-26
• 二、Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建26-44
• 2.1 對象和方法26-37
• 2.1.1 實驗對象26-30
• 2.1.2 實驗方法30-37
• 2.2 結(jié)果37-42
• 2.2.1 人源Foxp3 CDS區(qū)序列及PCR擴(kuò)增結(jié)果37-39
• 2.2.2 Foxp3 CDS區(qū)序列與T載體連接，酶切鑒定，及測序39-40
• 2.2.3 酶切T1-Foxp3，并與目的載體連接，酶切鑒定，及測序40-41
• 2.2.4 人源過表達(dá)Foxp3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和鼠源干擾Foxp3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的驗證41-42
• 2.3 討論42-43
• 2.4 小結(jié)43-44
• 三、體外胰腺癌細(xì)胞系對Treg細(xì)胞的趨化44-52
• 3.1 對象和方法44-47
• 3.1.1 實驗對象44
• 3.1.2 實驗方法44-47
• 3.2 結(jié)果47-51
• 3.2.1 不同細(xì)胞系過表達(dá)或干擾Foxp3效果驗證47-48
• 3.2.2 Treg細(xì)胞的純化48-49
• 3.2.3 不同細(xì)胞系過表達(dá)或干擾Foxp3與對照組相比，，對Treg細(xì)胞的趨化作用49-51
• 3.3 討論51
• 3.4 小結(jié)51-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明56-57
• 綜述 Foxp3、Foxp3+Treg細(xì)胞在腫瘤中的研究進(jìn)展57-67
• 綜述參考文獻(xiàn)62-67
• 致謝67-68

【相似文獻(xiàn)】

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5 保健時報記者 王朝建 通訊員 王懿輝;中年突發(fā)糖尿病當(dāng)心胰腺癌[N];保健時報;2012年

6 上海市腫瘤醫(yī)院胰腺肝膽外科主任醫(yī)師 虞先o

本文編號：612513