發(fā)布時間：2017-08-02 10:30

  本文關(guān)鍵詞：迷迭香酸對人胃癌MKN-45細胞裸鼠移植瘤及warburg效應(yīng)的影響

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【摘要】：胃癌是常見的消化道腫瘤,致死率高,限于經(jīng)濟水平以及對疾病認識,我國的胃癌以進展期多見。胃癌的進展與胃癌細胞所在的微環(huán)境息息相關(guān)。腫瘤細胞的代謝方式與代謝產(chǎn)物在微環(huán)境的形成中起重要作用。腫瘤細胞在有氧條件下仍以產(chǎn)生較少ATP的糖酵解為主要代謝方式,這是腫瘤的重要特征之一,這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)。Warburg效應(yīng)可以為腫瘤細胞快速供能,同時產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物可用以合成蛋白質(zhì)、核酸及脂類等生物大分子,為其自身生長和增殖提供必需的物質(zhì)基礎(chǔ),在腫瘤細胞抗凋亡、增殖和腫瘤微環(huán)境形成和維持中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Warburg效應(yīng)的主要表現(xiàn)為高葡萄糖消耗伴隨高乳酸生成,腫瘤的warburg效應(yīng)催生了氟脫氧葡萄糖正電子成像術(shù)(FDG-PET imaging),在臨床上廣泛應(yīng)用于腫瘤檢測,對于胃癌的術(shù)前分期敏感性及特異性較高,利用氣相色譜-質(zhì)譜分析法檢測胃腺癌組織,發(fā)現(xiàn)與正常胃組織相比,胃癌組織中諸如丙酮酸、乳酸、酮體等之類的糖酵解產(chǎn)物均升高。使葡萄糖代謝在胃癌的診療過程中發(fā)揮著越來越大的作用。研究證實在保證機體能量需求的情況下,減少葡萄糖的攝入,可抑制腫瘤細胞Warburg效應(yīng),延緩腫瘤生長。抑制Warburg效應(yīng)可阻止腫瘤細胞快速獲能,同時減少用于合成代謝的中間產(chǎn)物。但是目前缺乏有效的Warburg效應(yīng)抑制劑。近年來,中藥抗腫瘤研究已取得了較大的進展并得到國際公認,我國藥用植物資源豐富,有些藥物已經(jīng)表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是來源于唇形科植物迷迭香中的天然酚酸類化合物,由咖啡酸和3,4-二甲基苯基乳酸組成的酯類化合物,化學(xué)式為C18H1608,其水溶性好,廣泛存在于唇形科、紫草科、傘形科、葫蘆科和椴樹科等多種植物中。具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗血管生成等功能。在抗腫瘤方面,RA可抑制乳腺癌細胞的增殖,阻止其發(fā)生骨轉(zhuǎn)移；RA可抑制白血病細胞增殖,改善急性髓細胞白血病血液學(xué)參數(shù),延長生存期；RA可降低皮膚癌乳頭狀瘤數(shù)目、減輕腫瘤負荷；RA可抑制結(jié)腸癌細胞中ERK和Akt的磷酸化,阻斷MAPK/ERK通路,誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡,阻止其轉(zhuǎn)移。體外實驗發(fā)現(xiàn)迷迭香酸可減少胃癌MKN-45細胞葡萄糖消耗,降低乳酸的生成,抑制其warburg效應(yīng),加速其凋亡。但是迷迭香酸在體內(nèi)對胃癌的warburg效應(yīng)影響尚不清楚,本研究旨在研究迷迭香酸在體內(nèi)對人胃癌MKN-45細胞裸鼠移植瘤的作用及其對warburg效應(yīng)的影響,為進一步研究迷迭香酸對胃癌的影響奠定基礎(chǔ)。目的：觀察不同濃度迷迭香酸對人胃癌MKN-45細胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用,檢測其對腫瘤組織的葡萄糖消耗、乳酸產(chǎn)生量的影響,分析迷迭香酸對人胃癌MKN-45細胞裸鼠移植瘤warburg效應(yīng)中關(guān)鍵酶己糖激酶-2和乳酸脫氫酶-A的影響,探討迷迭香酸抑制裸鼠移植瘤生長及其對warburg效應(yīng)可能的作用機制。方法：細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清、0.1mg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞用于裸鼠接種。將生長至對數(shù)期人胃癌細胞MKN451×109細胞懸液接種于24只裸鼠右側(cè)腋窩外側(cè)皮下。當荷瘤裸鼠生長1周,腫瘤體積約為(74.08±17.89)mm3時,將24只荷瘤鼠隨機分為低劑量RA處理組、中劑量RA處理組、高劑量RA處理組、對照組4組,每組6只。處理組每次分別經(jīng)腹腔注射0.2ml迷迭香酸,濃度依次為1mg/kg.2mg/kg.4mg/kg,空白組予等量生理鹽水腹腔注射,每日處理2次,間隔12小時,每次給藥時稱量體重,按照體重變化調(diào)整給藥劑量,連續(xù)處理18天,每3天用游標卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的最長徑(a)和最小徑(b),按照體積(V)=a×b2/2計算腫瘤的體積,以腫瘤體積變化對時間繪制生長曲線。經(jīng)迷迭香酸處理后第19天將裸鼠麻醉后處死,剝離腫瘤稱重,計算腫瘤抑制率(%),腫瘤抑制率%=(對照組腫瘤重量-給藥組腫瘤重量)/對照組腫瘤重量×100%。ELISA法測瘤組織勻漿中IL-6的含量,稱取瘤組織重量,按重量(g)：體積(ml)=1：9的比例,加入9倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下2500轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘后取上清液,取瘤組織上清液按照ELISA試劑盒說明書進行測量IL-6表達水平。葡萄糖、乳酸試劑盒法檢測瘤組織勻漿中葡萄糖、乳酸的含量,取瘤組織上清液按照試劑盒說明書檢測葡萄糖、乳酸含量。Rt-PCR檢測IL-6 mRNA、STAT3 mRNA、HIF-lamRNA、HK-2 mRNA、LDHA mRNA的相對表達量,提取瘤組織中的總RNA,測定樣本A260/A280和樣本濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成HK-2、LDHA及內(nèi)參β-actin引物,按照天根公司SuperReal PreMix Plus試劑盒說明書,通過Bio-Rad公司PCR儀器(7500)SYBR Green分析法進行熒光定量PCR檢測,反應(yīng)條件：95℃ 15min; 95℃ 10s,60℃ 60s,40個循環(huán)；95℃ 15s,55℃ 45s, 95℃ 15s。最后以2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。Western blotting檢測STAT3 α、pSTAT-3α、HIF-1α、HK-2、LDHA蛋白的表達,提取組織中的總蛋白,BCA法測定蛋白含量后,經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗4℃過夜、二抗孵室溫育1小時、洗膜后避光孵育5分鐘,顯影采圖后采用Quantity one圖像處理軟件分析經(jīng)不同濃度迷迭香酸作用后移植瘤中STAT3 α、pSTAT-3α、HIF-1α、HK-2、LDHA的表達情況的表達變化。所有實驗數(shù)據(jù)處理統(tǒng)一使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組間腫瘤生長抑制率比較用卡方檢驗,計量資料用均數(shù)±標準差(f±s)表示,多組均數(shù)間比較用單因素方差分析,P0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：裸鼠移植瘤生長情況,接種后所有荷瘤鼠接種部位均可見圓形小皮丘,接種第7天所有荷瘤鼠接種部位均出現(xiàn)(74.08±17.89)mm3結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)邊緣形狀多不規(guī)則,觸之質(zhì)中偏韌,活動度尚可。各組裸鼠皮下結(jié)節(jié)大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.644,P=0.595),人胃癌MKN45細胞的裸鼠移植瘤模型建立成功,成瘤率100%。對照組與低、中劑量迷迭香酸處理組的裸鼠飲食、活動及生長均良好,但高劑量組裸鼠體重下降較快,在一定劑量范圍內(nèi),迷迭香酸干預(yù)實驗對裸鼠無明顯的行為學(xué)改變。對照組中移植瘤生長較快,經(jīng)迷迭香酸處理后生長較為緩慢。在經(jīng)過迷迭香酸處理12天后,移植瘤體積均小于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=137.34,P=0.000)。迷迭香酸能夠抑制裸鼠移植瘤的生長,且隨著劑量增大,抑制效應(yīng)越明顯。給藥結(jié)束后,處死荷瘤鼠,取瘤稱重。迷迭香酸各個劑量組的腫瘤重量均低于對照組,且抑制率均隨著迷迭香酸的劑量增大而上升,呈濃度依賴性。隨著迷迭香酸劑量加大,低、中、高劑量組的平均瘤重分別為(169.86±8.97)mg、(159.82±6.91)mg、(144.11±4.29) mg,低于對照組的瘤重(190.34±5.23)mg(F=51.592,P0.05),抑瘤率分別為10.76%、16.03%、24.29%。葡萄糖、乳酸試劑盒結(jié)果顯示,經(jīng)迷迭香酸處理后,移植瘤組織勻漿中葡萄糖的相對含量與對照組相比升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.302,P=0.026)。經(jīng)迷迭香酸處理后瘤組織勻漿中的乳酸相對含量較對照組降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.140,P=0.008)。ELISA結(jié)果顯示經(jīng)迷迭香酸作用后,瘤組織勻漿中IL-6的相對分泌量與對照組相比減少,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.140,P=0.008)。Rt-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)迷迭香酸處理后各移植瘤組織勻漿中IL-6 mRNA.STAT3 mRNA.HIF-1α mRNA、HK-2 mRNA、LDHA mRNA水平相對表達量低于對照組(均P0.05)。western blotting結(jié)果顯示,與對照組相比,經(jīng)不同劑量迷迭香酸處理后,移植瘤組織勻漿中TAT3α表達降低(F=39.630,P0.001),STAT-3α磷酸化后活化后形成pY705-STAT3 a的表達量也因迷迭香酸作用后表達降低(F=37.645,P0.001)。移植瘤組織中糖酵解途徑中起“限流作用”的HK-2表達下調(diào)(F=51.454,P0.001),HK-2可催化葡萄糖和ATP形成6-磷酸葡萄糖,且此反應(yīng)不可逆。LDHA表達也下調(diào)(F=25.273,P0.001),LDHA促進丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。移植瘤組織中作為聯(lián)系warburg效應(yīng)、缺氧、炎癥反應(yīng)等的樞紐HIF-1α表達也因謎底香酸的作用而表達下調(diào)(F=27.058,P0.001)。結(jié)論：迷迭香酸可減少腫瘤組織對葡萄糖的消耗、降低腫瘤組織中乳酸的產(chǎn)生量,抑制胃癌組織中腫瘤細胞的Warburg效應(yīng),同時抑制胃癌移植瘤生長�？赡芘c迷迭香酸可降低腫瘤微環(huán)境中的IL-6含量,減少STAT-3α活化,抑制胃癌移植瘤組織糖酵解過程中的LDHA等關(guān)鍵酶的表達等有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 Warburg效應(yīng) 迷迭香酸 白介素-6
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 前言14-23
• 1.1 胃癌的代謝變化14-15
• 1.2 缺氧對胃癌葡萄糖代謝的影響15-17
• 1.3 乳酸對腫瘤微環(huán)境的影響17-19
• 1.4 迷迭香酸對炎癥與腫瘤的影響19-23
• 第二章 迷迭香酸對人胃癌MKN-45細胞裸鼠移植瘤及warburg效應(yīng)的影響23-55
• 2.1 材料23-24
• 2.2 方法24-38
• 2.3 結(jié)果38-45
• 2.4 討論45-54
• 2.5 總結(jié)54-55
• 參考文獻55-59
• 綜述59-74
• 參考文獻70-74
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果74-75
• 致謝75-76

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本文編號：608841