本文關(guān)鍵詞：貝伐單抗通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡

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【摘要】：目的:觀察貝伐單抗對肺癌A549細(xì)胞的影響,探索其作用機(jī)制。方法:1.貝伐單抗處理A549細(xì)胞,A549細(xì)胞用含量為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng),培養(yǎng)在溫度37°C,CO2濃度5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。貝伐單抗用滅菌注射用水稀釋。細(xì)胞用濃度為0μM、1μM、5μM、25μM的貝伐單抗處理12、24、48或72小時(shí)。2.CCK-8法檢測A549細(xì)胞增殖抑制,A549細(xì)胞接種到96孔板中(100μL/孔),用不同濃度(0μM、1μM、5μM、25μM)的貝伐單抗處理12、24、48、72小時(shí)后,每孔加入10μL的CCK-8溶液。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小時(shí),用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光值。每次處理重復(fù)三次,計(jì)算平均值。3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡,A549細(xì)胞接種在60-mm平板過夜,用不同濃度(0μM、1μM、5μM、25μM)貝伐單抗處理24小時(shí),PBS緩沖液洗滌三次,0.25%tryptan-EDTA消化。離心后,將細(xì)胞在0.5ml PBS中的懸浮。細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(PI)染色,RNA酶和0.1%Triton X-100室溫處理30分鐘。用熒光激活細(xì)胞分選儀進(jìn)行流式細(xì)胞分析。4.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測RNA表達(dá),總m RNA的提取來自經(jīng)不同濃度(0μM、1μM、5μM、25μM)貝伐單抗處理的細(xì)胞,使用Ambion RNA-queous試劑盒。高容量c DNA Archive試劑盒用來獲得的m RNA的第一鏈c DNA。CHOP、caspase-4、IRE1、XBP-1的m RNA水平檢測通過特異性基因表達(dá)測定試劑盒、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測系統(tǒng)完成。5.蛋白免疫印跡技術(shù)檢測蛋白表達(dá),將細(xì)胞溶解,收集上清液,用已知的方法萃取胞漿蛋白或核蛋白。在電壓為120m V的三鹽酸聚丙烯酰胺凝膠,將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯印跡膜,膜上用特異性多克隆抗體做探針。從蛋白裂解液中取得相同的蛋白量進(jìn)行電泳分析,β-actin做為內(nèi)參。結(jié)果:1.貝伐單抗處理肺癌A549細(xì)胞12小時(shí),表現(xiàn)出對細(xì)胞增殖的抑制作用輕微,但處理24小時(shí)后則顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并呈劑量依賴性。與此相反,作為對照組的貝伐單抗(0μM)在對任一時(shí)間處理過的細(xì)胞系中沒有顯著抑制作用。這些數(shù)據(jù)表明,貝伐單抗可抑制A549細(xì)胞增殖。2.我們采用流式細(xì)胞儀評估貝伐單抗對A549細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明,在使用貝伐單抗處理24小時(shí)后,可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這表明貝伐單抗參與了導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的信號通路。3.我們進(jìn)一步研究了貝伐單抗通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介導(dǎo)的途徑誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的可能性。細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的未折疊蛋白反應(yīng)((unfolded protein response,UPR)中,我們選取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上游肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1,IRE-1)、X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)作為檢測指標(biāo),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)性凋亡(endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis,ERSIA)信號通路中選取C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)、半胱天冬氨酸4(caspase-4)作為檢測指標(biāo)。結(jié)果表明,在RNA水平較對照組(0μM)而言,XBP-1在濃度為1μM、5μM、25μM各組的表達(dá)均明顯增加,為2.196±0.101,4.605±0.413,2.532±0.185(p0.01);CHOP(25μM)組及caspase-4(5μM)組的表達(dá)也有小幅增加,為2.191±0.112,1.588±0.167(p0.05)。在蛋白水平,CHOP的表達(dá)水平較對照組(0μM)0.33±0.08而言,濃度為1μM、5μM、25μM各組的表達(dá)均明顯增加,為0.67±0.08,1.52±0.24,1.32±0.31(p0.05);caspase-4的表達(dá)較對照組(0μM)0.24±0.08而言,濃度為5μM、25μM兩組的表達(dá)均有增加,為0.65±0.15,0.63±0.23(p0.05)。我們的數(shù)據(jù)顯示貝伐單抗激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)性凋亡級聯(lián)反應(yīng)。結(jié)論:1.貝伐單抗在體外可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖2.貝伐單抗在體外可促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡3.貝伐單抗在抑制肺癌A549細(xì)胞增殖以及在促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡過程中,出現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路的活化。4.貝伐單抗通過加重細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：貝伐單抗 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 A549細(xì)胞 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 主要縮略詞簡表13-14
• 第1章 前言14-16
• 第2章 材料與方法16-28
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-32
• 第4章 討論32-36
• 第5章 結(jié)論36-38
• 參考文獻(xiàn)38-42
• 附圖42-50
• 綜述50-60
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 攻讀碩士學(xué)位期間撰寫論文60-62
• 致謝62

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本文編號：608640