本文關(guān)鍵詞：自噬在白樺酸抗結(jié)直腸癌效應(yīng)中的作用和機(jī)制研究

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【摘要】：結(jié)直腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)病率有明顯上升的趨勢,并且治愈率低,嚴(yán)重威脅人類健康。腫瘤預(yù)防與治療的進(jìn)步離不開新的化學(xué)治療藥物的開發(fā),最近發(fā)現(xiàn)最有希望應(yīng)用于腫瘤治療的的天然化合物是三萜類化合物,其中白樺酸是最典型的代表。已有研究顯示,白樺酸在肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中具有抗腫瘤效應(yīng),但其在結(jié)直腸癌中的治療作用尚未見報(bào)道。此外,細(xì)胞自噬屬于II型程序性細(xì)胞死亡,其相關(guān)機(jī)制研究已成為腫瘤治療研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。本論文對白樺酸抗結(jié)直腸癌的效應(yīng)以及自噬在該效應(yīng)中的作用及機(jī)制進(jìn)行了初步系統(tǒng)研究。(1)白樺酸通過促調(diào)亡作用抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖使用對照和不同濃度的白樺酸,分別處理結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480和HT29 48h。細(xì)胞增殖分析顯示,白樺酸顯著抑制上述結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖,并且抑制程度具有濃度依賴性。進(jìn)而,采用Annexin-V/PI雙染法流式凋亡檢測、DAPI細(xì)胞核染色和Western Blot對細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析。流式結(jié)果顯示,在以上三種結(jié)直腸癌細(xì)胞中,與對照組相比,白樺酸處理組細(xì)胞凋亡比率顯著增多,并且凋亡率具有濃度依賴性;DAPI染核結(jié)果顯示,隨著白樺酸處理濃度的增大,細(xì)胞核固縮程度依次遞增,并且出現(xiàn)核固縮的細(xì)胞數(shù)量依次遞增;Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,白樺酸處理組促凋亡因子caspase3激活和parp蛋白剪切增加。上述結(jié)果提示,白樺酸可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。(2)白樺酸促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的發(fā)生和自噬流的形成透射電鏡觀察結(jié)果顯示,在hct116細(xì)胞中,與對照組相比,白樺酸處理組細(xì)胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量和含有5個(gè)以上自噬泡的細(xì)胞數(shù)量均顯著增多。吖啶橙染色結(jié)果顯示,隨著白樺酸處理濃度的增加,三種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中酸性自噬泡的數(shù)量均顯著增加。同時(shí),激光共聚焦或者熒光顯微鏡觀察顯示,隨著白樺酸處理濃度的增加,上述細(xì)胞中l(wèi)c3斑點(diǎn)逐漸增多,并且含有l(wèi)c3斑點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量也逐漸增多。間接免疫熒光結(jié)果顯示,與對照組相比,白樺酸處理組細(xì)胞內(nèi)lc3斑點(diǎn)數(shù)量顯著增多。westernblot結(jié)果顯示,lc3-i轉(zhuǎn)化為lc3-ii。rt-pcr結(jié)果顯示,白樺酸顯著誘導(dǎo)了atg5等自噬關(guān)鍵基因的表達(dá)。上述結(jié)果表明,白樺酸能顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬發(fā)生。此外,免疫共定位分析顯示,白樺酸可以促進(jìn)自噬溶酶體的增多。westernblot結(jié)果顯示,氯喹或蛋白酶抑制劑處理可進(jìn)一步促進(jìn)白樺酸誘發(fā)的lc3-ii積累。這些結(jié)果表明,白樺酸可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬流的形成。(3)白樺酸通過抑制akt-mtor信號(hào)通路促進(jìn)自噬發(fā)生Akt-mtor是調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典信號(hào)通路,可抑制自噬發(fā)生。westernblot結(jié)果顯示,與對照組相比,在結(jié)直腸癌細(xì)胞中,白樺酸處理組細(xì)胞的磷酸化mtor和磷酸化akt蛋白表達(dá)均顯著降低,提示白樺酸通過抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞Akt-mTOR信號(hào)通路而激活自噬。(4)抑制自噬可增強(qiáng)白樺酸對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)細(xì)胞增殖分析結(jié)果顯示,采用自噬抑制劑氯喹處理或者si RNA介導(dǎo)的自噬關(guān)鍵基因ATG5基因沉默策略分別抑制自噬,均能顯著增強(qiáng)白樺酸對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖抑制率。同時(shí),Annexin-V/PI雙染法流式檢測凋亡結(jié)果顯示,抑制自噬也進(jìn)一步顯著促進(jìn)了白樺酸誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡;Western Blot結(jié)果顯示,抑制自噬還顯著促進(jìn)了促凋亡蛋白PARP的剪切激活以及抗凋亡因子bcl-xl的下調(diào),反向提示自噬可以抑制白樺酸對結(jié)直腸癌細(xì)胞的促凋亡和增殖抑制效應(yīng)。綜上,本研究的結(jié)果表明,白樺酸可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,白樺酸還可通過抑制Akt-mTOR信號(hào)通路而激活結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬,而抑制自噬則可增強(qiáng)白樺酸在結(jié)腸癌細(xì)胞中的抗腫瘤效應(yīng)。本研究初步系統(tǒng)闡釋了白樺酸的抗結(jié)直腸癌效應(yīng)與機(jī)制,為進(jìn)一步的機(jī)制研究以及未來將白樺酸開發(fā)為新型的抗腫瘤藥物奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ),具有積極的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
【關(guān)鍵詞】：白樺酸 結(jié)直腸癌 凋亡 自噬 增殖
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-13
• 前言13-14
• 1 材料與方法14-20
• 2 結(jié)果20-37
• 3 討論37-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 文獻(xiàn)綜述44-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 致謝59-60
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄60

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