發(fā)布時(shí)間：2017-07-30 02:01

  本文關(guān)鍵詞：姜黃素聯(lián)合吉非替尼對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究目的：研究姜黃素聯(lián)合吉非替尼對人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞耐藥性,以及增殖克隆、凋亡的影響,并進(jìn)一步探討其可能的分子機(jī)制。研究方法：通過早期實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)吉非替尼對NCI-H1975細(xì)胞的IC50為8μmol/L,姜黃素對NCI-H1975細(xì)胞的IC15為10ng/ml。以不同濃度的吉非替尼(2、4、6、8、10) μmol/L單獨(dú)或聯(lián)合10ng/ml姜黃素處理細(xì)胞,設(shè)立不給藥作為空白對照組,每個(gè)處理組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24小時(shí)后采用四甲基偶氮唑(MTT)比色法檢測姜黃素聯(lián)合吉非替尼對吉非替尼抑制NCI-H1975細(xì)胞增殖抑制的影響。同時(shí),分別以IC15濃度的姜黃素10ng/ml、IC50濃度的吉非替尼8μmol/L、及兩藥聯(lián)用(姜黃素10ng/ml+吉非替尼8μmol/)處理細(xì)胞,設(shè)立不給藥為空白對照,利用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測兩藥單獨(dú)及聯(lián)合處理后對NCI-H1975細(xì)胞凋亡的影響；用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測MAPK途徑中的P-P38、P-ERK1/2、 P-NF-κB,PI3K/AKT途徑中的P-AKT蛋白表達(dá)；通過集落形成實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)克隆集落數(shù)的方法,研究姜黃素、吉非替尼單獨(dú)及聯(lián)合處理NCI-H1975細(xì)胞后細(xì)胞的克隆形成能力；用鼠抗人抗P-gp-FITC單克隆抗體對姜黃素、吉非替尼單獨(dú)及聯(lián)合藥物處理后的細(xì)胞進(jìn)行染色,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞膜表面P糖蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果：1.MTT法檢測不同濃度的吉非替尼(2、4、6、8、10)μmol/L單獨(dú)或聯(lián)合10ng/ml姜黃素處理細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立不給藥作為空白對照組,每個(gè)處理組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分析結(jié)果顯示,藥物處理24h后,姜黃素與吉非替尼聯(lián)合用藥較單用吉非替尼在各濃度上(2、4、6、8、10μmol/L)均可提高吉非替尼對NCI-H1975細(xì)胞的增殖抑制作用(p0.05)；lOng/ml姜黃素聯(lián)合吉非替尼可降低吉非替尼的半數(shù)抑制濃度IC50(1.98±0.67μmol/L VS 8.15±2.31μmol/L),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.利用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測以10ng/ml濃度的姜黃素、8μmol/L濃度的吉非替尼及兩藥聯(lián)用(姜黃素10ng/ml+吉非替尼8μmol/)對NCI-H1975細(xì)胞作用24小時(shí)后細(xì)胞的凋亡率,同時(shí)設(shè)立不給藥作為空白對照組�？瞻捉M、姜黃素、吉非替尼及兩藥聯(lián)用早期凋亡率分別為2.94±1.44%、3.48±2.18%、14.31±4.96%、41.09±9.82%,流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示NCI-H1975細(xì)胞在姜黃素、吉非替尼的聯(lián)合作用下,較單用吉非替尼呈現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞更為明顯的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)(p0.05),提示姜黃素可以促進(jìn)吉非替尼體外誘導(dǎo)NCI-H1975的凋亡。3.分別用lOng/ml濃度的姜黃素、8μmol/L濃度的吉非替尼及兩藥聯(lián)用(姜黃素10ng/ml+吉非替尼8μmol/)對NCI-H1975細(xì)胞作用24小時(shí)后,Western Blotting法檢測EGFR下游MAPK途徑中的P-P38、P-ERK1/2、P-NF-κB以及PI3K/AKT途徑中的P-AKT蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),姜黃素聯(lián)合吉非替尼較單用吉非替尼或單用姜黃素可更顯著抑制P38、ERK1/2、NF-κB、AKT的磷酸化水平。4.分別以lOng/ml濃度的姜黃素、8μmol/L濃度的吉非替尼及兩藥聯(lián)用(姜黃素10ng/ml+吉非替尼8μmol/)處理培養(yǎng)于甲基纖維素半固體培養(yǎng)皿中對數(shù)生長期的NCI-H1975細(xì)胞,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天后,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)≥30個(gè)細(xì)胞的集落,計(jì)算克隆集落數(shù),結(jié)果顯示姜黃素(lOng/ml)±吉非替尼(8μmol/L)聯(lián)合作用,較單用吉非替尼(8μmol/L)呈現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞克隆形成更為明顯的抑制效應(yīng)(p0.05),提示姜黃素可以提高吉非替尼對NCI-H1975克隆形成能力的抑制作用。5.分別以姜黃素lOng/ml、吉非替尼8μmol/L,及姜黃素10ng/ml+吉非替尼8μmol/L對腫瘤細(xì)胞NCI-H1975作用24小時(shí),同時(shí)設(shè)立不加藥為空白對照組,用鼠抗人抗P-gp-FITC單克隆抗體對藥物處理后的細(xì)胞進(jìn)行染色,然后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測P糖蛋白(P-glycoproein, P-gp),結(jié)果顯示單用姜黃素組及兩藥聯(lián)用組P糖蛋白表達(dá)明顯低于空白組(p0.05),提示姜黃素可下調(diào)P糖蛋白表達(dá)研究結(jié)論：1.姜黃素可顯著降低NCI-H1975對吉非替尼的IC50,姜黃素降低NCI-H1975耐藥性可能與降低腫瘤細(xì)胞表面P糖蛋白有關(guān)。2.姜黃素聯(lián)合吉非替尼可顯著提高吉非替尼對NCI-H1975細(xì)胞增殖抑制、阻礙克隆形成、誘導(dǎo)凋亡的作用。3.姜黃素提高吉非替尼對NCI-H1975細(xì)胞藥理作用的分子機(jī)制可能為促進(jìn)吉非替尼對EGFR下游MAPK及PI3K/AKT通路磷酸化水平的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：非小細(xì)胞肺癌 姜黃素 吉非替尼 增殖抑制 細(xì)胞凋亡 NCI-H1975細(xì)胞 耐藥
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 縮略語12-14
• 1 研究背景14-18
• 2 材料與方法18-23
• 2.1 研究對象18
• 2.2 主要試劑與儀器18-19
• 2.3 主要實(shí)驗(yàn)步驟19-22
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理22-23
• 3 結(jié)果23-33
• 3.1 姜黃素聯(lián)合吉非替尼可增強(qiáng)吉非替尼對NCI-H1975細(xì)胞的增殖抑制作用23-24
• 3.2 姜黃素聯(lián)合吉非替尼可促進(jìn)吉非替尼誘導(dǎo)NCI-H1975細(xì)胞凋亡24-26
• 3.3 姜黃素聯(lián)合吉非替尼可增強(qiáng)吉非替尼對NCI-H1975細(xì)胞克隆集落形成抑制作用26-28
• 3.4 姜黃素聯(lián)合吉非替尼可增強(qiáng)吉非替尼對NCI-H1975細(xì)胞多條信號通路活化的抑制28-30
• 3.5 姜黃素可下調(diào)NCI-H1975細(xì)胞P-gp的表達(dá)30-33
• 4 討論33-38
• 5 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 綜述43-55
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 作者簡歷及在學(xué)期間所取得的科研成果55

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：591991