本文關(guān)鍵詞：納米金顆粒介導(dǎo)的高效篩選免疫原性多肽的研究

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【摘要】：腫瘤對(duì)人類健康的危害非常嚴(yán)重,盡管醫(yī)學(xué)科技領(lǐng)域科學(xué)家們也一直致力于治愈腫瘤,然而至今它依然是一種難以攻克的疾病。腫瘤免疫治療方法的出現(xiàn),燃起了人們新的希望,隨著研究的深入,腫瘤的免疫治療正取得越來(lái)越明確的效果,這一治療手段已使很多患者受益,因此也被《科學(xué)》雜志評(píng)列為2013年十大科學(xué)突破之首。免疫治療可分為抗體免疫治療和細(xì)胞免疫治療。在這兩種途徑中,抗體免疫治療法采用PD-1或CTLA-4等免疫檢查點(diǎn)抑制抗體消除體內(nèi)環(huán)境對(duì)T細(xì)胞的抑制,使其能夠繼續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞;細(xì)胞抗腫瘤免疫治療則是通過(guò)體外培養(yǎng)患者自身的免疫細(xì)胞,激活其免疫功能并回輸至患者體內(nèi)發(fā)揮作用,常見(jiàn)的有DC-CTL療法及表達(dá)嵌合抗原受體的自體T細(xì)胞(CAR-T)療法等。在腫瘤免疫治療過(guò)程中,腫瘤抗原需要能夠被正確的遞呈給淋巴細(xì)胞,形成針對(duì)腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞克隆,進(jìn)而形成有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。通常來(lái)說(shuō),這一過(guò)程借由抗原遞呈細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)攝取、加工處理并遞呈。嵌合抗原受體方法的出現(xiàn)則直接將包含腫瘤抗原識(shí)別區(qū)的序列通過(guò)基因修飾的方法直接導(dǎo)入T細(xì)胞,從而識(shí)別攜帶特定抗原的腫瘤細(xì)胞并引發(fā)免疫反應(yīng)。但無(wú)論何種方法,其核心都需要建立在正確的腫瘤抗原基礎(chǔ)上。隨著基因組測(cè)序技術(shù)快速進(jìn)步以及生物信息與大數(shù)據(jù)科學(xué)的發(fā)展,腫瘤的異質(zhì)性不斷地被揭示。因此,如何在癌癥的大量突變基因中快速準(zhǔn)確地篩選出具有治療效應(yīng)的抗原信息是新型精準(zhǔn)醫(yī)療概念的重要組成部分。計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的成熟使抗原表位的預(yù)測(cè)及高通量篩選成為了一種可能,已有研究結(jié)果證實(shí)模擬預(yù)測(cè)的多肽序列能夠具有較強(qiáng)的免疫原性。但在實(shí)際操作中,受限于計(jì)算條件及時(shí)效性的影響,需要更為普適的篩選方法。目前常用的能夠?qū)⒍嚯膶?dǎo)入細(xì)胞的方法包括電轉(zhuǎn)法、脂質(zhì)體法及腺病毒法等,但各有其劣勢(shì)且均不適合高通量篩選的目的。本課題涉及的納米金顆粒在攜帶各種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞方面擁有許多臨床應(yīng)用,相比其他材料、方法擁有更多的優(yōu)勢(shì),但將其用于抗原表位的篩選卻罕有報(bào)導(dǎo)。因此,本課題選擇納米金顆粒作為高通量篩選的載體,通過(guò)其與抗原多肽的偶聯(lián),進(jìn)入抗原遞呈細(xì)胞,最后通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)精確檢測(cè)抗原多肽的免疫原性強(qiáng)弱,達(dá)到篩選目的。本課題從光譜分析上證實(shí)納米金顆粒與合成多肽的偶聯(lián),從熒光及電鏡圖片上直接證實(shí)其進(jìn)入細(xì)胞,從T細(xì)胞IFN-γ的分泌上驗(yàn)證了不同多肽的免疫原性,確立了整體實(shí)驗(yàn)方法的可行性。同時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)參數(shù)如pH、緩沖液、培養(yǎng)時(shí)間等進(jìn)行了優(yōu)化,從待篩選多肽的合成直至免疫原性結(jié)果的分析所需的時(shí)間非常短。并且成功將體系縮小至96孔板規(guī)模,從而實(shí)現(xiàn)高通量篩選的最終目的。本課題涉及的抗原表位高通量篩選平臺(tái)技術(shù)聯(lián)合計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)抗原表位技術(shù)必將極大地推動(dòng)腫瘤的精準(zhǔn)治療的發(fā)展與應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：納米金顆粒 高通量篩選 免疫原性多肽 抗原表位
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.51
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 緒論12-21
• 1 前言12
• 2 腫瘤療法簡(jiǎn)介12-13
• 2.1 手術(shù)切除法12-13
• 2.2 化學(xué)治療法13
• 2.3 靶向治療法13
• 3 腫瘤的免疫治療13-16
• 3.1 細(xì)胞免疫治療14
• 3.2 抗體免疫治療14-15
• 3.3 免疫應(yīng)答機(jī)制15-16
• 4 腫瘤抗原的加工處理16-18
• 4.1 傳統(tǒng)導(dǎo)入法16-17
• 4.2 納米金導(dǎo)入法17-18
• 5 研究目的及意義18-20
• 6 技術(shù)方法和路線20-21
• 第二章 納米金顆粒與多肽偶聯(lián)條件的探索21-34
• 1 前言21
• 2 材料與方法21-26
• 2.1 材料、儀器和試劑21-23
• 2.1.1 主要材料21
• 2.1.2 主要儀器21-22
• 2.1.3 主要試劑22-23
• 2.1.4 試劑配制23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-26
• 2.2.1 免疫原性多肽的合成23-24
• 2.2.2 納米金顆粒與多肽偶聯(lián)24-25
• 2.2.2.1 不同pH對(duì)偶聯(lián)的影響24
• 2.2.2.2 不同稀釋劑對(duì)偶聯(lián)的影響24-25
• 2.2.2.3 金硫不同摩爾比對(duì)偶聯(lián)的影響25
• 2.2.3 高通量篩選多肽25
• 2.2.4 熒光顯微鏡及電鏡檢測(cè)細(xì)胞攝取情況25
• 2.2.5 初步檢測(cè)多肽免疫原性25-26
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-33
• 3.1 不同pH對(duì)納米金顆粒與免疫原性多肽偶聯(lián)的影響26-27
• 3.2 不同稀釋劑對(duì)納米金顆粒與免疫原性多肽偶聯(lián)的影響27-28
• 3.3 金硫不同摩爾比對(duì)偶聯(lián)的影響28-29
• 3.4 高通量篩選多肽29-30
• 3.5 偶聯(lián)復(fù)合物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及電鏡檢測(cè)30-32
• 3.6 不同多肽進(jìn)入細(xì)胞后的免疫原性檢測(cè)32-33
• 4 討論33-34
• 第三章 納米金顆粒與多肽偶聯(lián)復(fù)合物功能研究34-42
• 1 前言34
• 2 材料與方法34-37
• 2.1 材料、儀器和試劑34-36
• 2.1.1 主要材料34
• 2.1.2 主要儀器34-35
• 2.1.3 主要試劑35
• 2.1.4 試劑配制35-36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法36-37
• 2.2.1 293A細(xì)胞培養(yǎng)36
• 2.2.2 巨噬細(xì)胞制備及培養(yǎng)36
• 2.2.3 DC細(xì)胞的制備36
• 2.2.4 細(xì)胞與偶聯(lián)復(fù)合物作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞攝取效率的影響36-37
• 2.2.5 細(xì)胞與偶聯(lián)復(fù)合物不同體積比對(duì)細(xì)胞攝取效率的影響37
• 2.2.6 免疫原性多肽的篩選37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-41
• 3.1 不同種類的細(xì)胞對(duì)于納米金-多肽復(fù)合物的攝取能力探究37-38
• 3.2 不同處理時(shí)間對(duì)于細(xì)胞攝取偶聯(lián)復(fù)合物的影響38-39
• 3.3 多肽免疫原性檢測(cè)39-41
• 4 討論41-42
• 第四章 結(jié)論和展望42-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 致謝49

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