本文關(guān)鍵詞：EB病毒核抗原（NA1）IgA抗體和Zta蛋白IgA抗體時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的研制

  更多相關(guān)文章： 時間分辨熒光免疫分析 EBNA1 IgA Zta IgA 鼻咽癌 檢測

【摘要】：研究背景及目的EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是1964年Epstein和Barr在研究非洲兒童的惡性淋巴瘤時,從瘤細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的一種嗜人類B淋巴細(xì)胞的γ皰疹病毒,基因組全長184kb。EB病毒在人群中的感染率達(dá)到90%以上,并與多種人類疾病相關(guān),包括傳染性單核細(xì)胞增多癥、EB病毒相關(guān)淋巴細(xì)胞增生性噬血綜合征、慢性活動性EB病毒感染、EB病毒相關(guān)性免疫缺陷病及EB病毒感染相關(guān)性腫瘤(如鼻咽癌、胃癌、伯基特淋巴瘤、T/NK細(xì)胞淋巴瘤等)等。其中,鼻咽癌是第一個被發(fā)現(xiàn)與EB病毒感染有關(guān)的人類癌癥,且研究證實95%以上未分化型鼻咽癌組織中均可檢測出EBV感染。自外國醫(yī)學(xué)研究人員0ld LJ等報告使用免疫擴散實驗確認(rèn)EB病毒與鼻咽癌的血清學(xué)有關(guān)以來,國內(nèi)外對EB病毒作了大量研究均發(fā)現(xiàn)抗EB病毒抗原的免疫球蛋白對鼻咽癌診斷有特異性。EB病毒感染機體后以兩種狀態(tài)存在：①潛伏期：此期病毒不進行復(fù)制,細(xì)胞主要合成核心抗原(Epstein-Barr virus associated nuclear antigen, EBNA)和潛伏膜蛋白(latent membrane protein, LMP);②裂解期：此期病毒基因完全表達(dá),合成的病毒蛋白分為立早蛋白(zta)、早期蛋白(earlyintracellular antigen, EA)、衣殼抗原(Epstein-Barr virus capsid antigen, VCA)和晚期蛋白,在NPC患者中可檢測到上述抗原的相應(yīng)抗體。EBNA1是在EBV感染細(xì)胞早期出現(xiàn)的抗原,它的作用主要是調(diào)節(jié)EBV基因的復(fù)制,增強病毒基因的轉(zhuǎn)錄,維持病毒附加子的存在；另外也可與EBV潛伏感染時的復(fù)制起始點中的重復(fù)序列家族結(jié)合,激活LMP1的啟動子,促進其轉(zhuǎn)錄。它會持續(xù)存在于病毒復(fù)制周期的最后階段,已有報道EBNA1在檢測鼻咽癌方面的靈敏度和特異度分別是91.9%和91.4%,且認(rèn)為EBNA1是檢測鼻咽癌的一個理想指標(biāo)。目前,臨床中常用的EBNA1 IgA檢測試劑主要是進口及國產(chǎn)的ELISA檢測試劑,它較細(xì)胞涂片方法簡單、快捷、檢驗結(jié)果易判斷。但依然存在一些不足：靈敏度、重復(fù)性不好；酶的純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響,導(dǎo)致穩(wěn)定性不好。本研究中我們采用時間分辨熒光免疫分析技術(shù)研制EBNA1 IgA檢測試劑。TRFIA具有靈敏度高,檢測范圍寬,熒光壽命長,Stoke位移大,容易自動化,不易受干擾,無放射性同位素污染的特點,它可替代酶免法用于臨床診斷。另外,因TRFIA法具有標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、應(yīng)用范圍廣泛、重復(fù)性好等優(yōu)點,在下一步研制EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析法定量檢測試劑盒較其他方法具有明顯優(yōu)勢。Zta是EBV最重要的立早蛋白之一,被認(rèn)為是EBV由潛伏期進入裂解期的開關(guān)分子。Zta作為EBV的重要轉(zhuǎn)錄因子,通過啟動一系列早期和晚期蛋白的瀑布式轉(zhuǎn)錄表達(dá),導(dǎo)致EBV由潛伏期進入裂解期。在20世紀(jì)90年代已有研究發(fā)現(xiàn)可通過檢測EB病毒Zta抗體輔助診斷鼻咽癌,近幾年國內(nèi)也有一些研究評價EB病毒Zta抗體用于輔助診斷鼻咽癌的準(zhǔn)確性,證實EB病毒Zta抗體檢測用于鼻咽癌診斷的準(zhǔn)確性較高,特別是在鼻咽癌篩查中有很高的特異度,具有較高的診斷價值和應(yīng)用前景。加強研制開發(fā)檢測該蛋白體外診斷試劑盒是臨床醫(yī)生和診斷試劑廠家關(guān)注的重點,但是目前檢測領(lǐng)域己注冊的僅有一個商品化的產(chǎn)品,應(yīng)用時間分辨免疫分析技術(shù)檢測EB病毒Zta抗體目前尚未見報道。本研究采用時間分辨熒光免疫分析技術(shù)研制EB病毒NA1 IgA、Zta IgA檢測試劑,通過評價各項性能指標(biāo),并與其他檢測試劑盒進行比較,評價其在臨床檢測應(yīng)用中的可行性。方法：(一)EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑1.1 EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的工藝優(yōu)化。1.1.1采用間接法研制EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑。1.1.2配置NA1 IgA陰性對照品、陽性對照品：陰性對照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒核抗原(NA1) IgA抗體ELISA檢測陰性的正常人血清；陽性對照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒核抗原(NA1) IgA抗體ELISA檢測為陽性的血清。1.1.3銪標(biāo)記抗體與純化：將0.5mg抗人IgA抗體加入50KD的蛋白超濾離心柱中,用標(biāo)記緩沖液重復(fù)洗滌,9000r/min離心,每次6min,共6次。純化抗體后,按質(zhì)量比5：1的比例加入銪標(biāo)記配體,標(biāo)記體系為200 u L,將待標(biāo)記抗體與銪標(biāo)記試劑充分混勻后置于搖床25℃震蕩過夜,次日過分子篩層析純化,收集洗脫液,1mL/管,逐管測熒光值,合并高值的洗脫液,并用BCA法檢測收集的洗脫液的終濃度,最后加入0.1%濃度的BSA作保護劑,-20℃保存。1.1.4包被濃度的確定：為確定最佳的NAl抗原的包被濃度,我們選取了0.5 ug/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、 2g/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、4μg/mL七個不同的包被濃度梯度。在不同的包被濃度下,觀察所選的陰性樣本、陽性樣本及陰性對照和陽性對照的熒光值,以熒光值趨于穩(wěn)定為最佳的包被濃度。1.1.5銪標(biāo)稀釋比的確定：用稀釋液將標(biāo)記抗體分別稀釋成1：400、1：600、1：800、1：1000、1：2000、1：4000、1：6000七個不同的稀釋比。不同的銪標(biāo)記抗體稀釋比下,觀察所選陰性樣本、陽性樣本及陰性對照和陽性對照的熒光值變化,在本底較低的情況下,取陽性樣本和陰性樣本的熒光值比值高,區(qū)別比較大的為最佳稀釋比。1.1.6反應(yīng)時間的確定：在其他反應(yīng)條件確定的前提下,我們分別設(shè)定15min、 30min、45min、60min、90min、120min六個反應(yīng)時間,觀察所選樣本及陰性對照和陽性對照熒光值隨著反應(yīng)時間增加所發(fā)生的變化,以熒光值趨于平衡的時間作為體系的最佳反應(yīng)時間。1.2 EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的分析性能評價1.2.1精密度實驗：重復(fù)測定三個不同樣本(S1、S2、S3)的熒光值,得到每個樣本的均值、標(biāo)準(zhǔn)差,計算分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)。1.2.2特異性實驗：巨細(xì)胞病毒陽性樣本,單純皰疹病毒Ⅰ型陽性樣本,單純皰疹病毒Ⅱ型陽性樣本,乙型肝炎陽性樣本,丙型肝炎陽性樣本各十例,以自制試劑檢測上述血清,觀察其檢測結(jié)果,評價檢測的交叉反應(yīng)性。1.2.3抗干擾性分析：陰性對照、陽性對照中加入一定量的甘油三酯、血紅蛋白和膽紅素,對其進行測定,計算平均值。1.3試劑盒臨床性能評估1.3.1 參考值的確定：以自制的EB病毒NA1 IgA時間分辨熒光免疫分析試劑盒檢測420份健康人血清,統(tǒng)計血清熒光值的分布情況,計算樣本熒光值與陰性對照的比值。取涵蓋99%以上正常樣本的界值,初步確定為試劑盒的正常人參考值,再結(jié)合ROC曲線最終確定參考值范圍。1.3.2與對照試劑盒ELISA的比較試驗：用自制試劑盒和對照試劑盒同時對509份血清樣本進行檢測,對其陰性符合率和陽性符合率進行比較。(二)EB病毒Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑2.1EB病毒Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的工藝優(yōu)化。2.1.1采用間接法研制EB病毒Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑。2.1.2配置Zta IgA陰性對照品、陽性對照品：陰性對照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒Zta蛋白IgA抗體ELISA檢測陰性的正常人血清；陽性對照品用稀釋緩沖液稀釋抗EB病毒Zta蛋白IgA抗體ELISA檢測為陽性的血清。2.1.3銪標(biāo)記抗體與純化：將0.5mg抗人IgA抗體加入50KD的蛋白超濾離心柱中,用標(biāo)記緩沖液重復(fù)洗滌,9000r/min離心,每次6min,共6次。純化抗體后,按質(zhì)量比5：1的比例加入銪標(biāo)記配體,標(biāo)記體系為200μ L,將待標(biāo)記抗體與銪標(biāo)記試劑充分混勻后置于搖床,25℃震蕩過夜,次日過分子篩層析純化,收集洗脫液,1mL/管,逐管測熒光值,合并高值的洗脫液,并用BCA法檢測收集的洗脫液的終濃度,最后加入1‰濃度的BSA作保護劑,-20℃保存。2.1.4包被濃度的確定：為確定最佳的Zta抗原的包被濃度,我們選取了0.5 μg/mL,1μg/mL、μ1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3μg/mL、4μg/mL七個不同的包被濃度梯度。在不同的包被濃度下,觀察所選的陰性樣本、陽性樣本及陰性對照和陽性對照的熒光值,以熒光值趨于穩(wěn)定時選其為最佳的包被濃度。2.1.5銪標(biāo)稀釋比的確定：用稀釋液將標(biāo)記抗體分別稀釋成1：400、1：600、1：800、1：1000、1：2000、1：4000、1：6000七個不同的稀釋比。不同的銪標(biāo)記抗體稀釋比下,觀察所選陰性樣本、陽性樣本及陰性對照和陽性對照的熒光值變化,在本底較低的前提下,取陽性樣本熒光值和陰性樣本熒光值比值高,區(qū)別比較大的為最佳稀釋比。2.1.6反應(yīng)時間的確定：在其他反應(yīng)條件確定的前提下,我們分別設(shè)定30min、 45min、60min、90min、120min五個反應(yīng)時間,觀察所選樣本及陰性對照和陽性對照熒光值隨著反應(yīng)時間增加所發(fā)生的變化,以熒光值趨于平衡的時間作為體系的最佳反應(yīng)時間。2.2 EB病毒Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的分析性能評價2.2.1精密度實驗：重復(fù)測定三個不同樣本(Sl、S2、S3)的熒光值,得到每個樣本的均值、標(biāo)準(zhǔn)差,計算分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)。2.2.2特異性實驗：巨細(xì)胞病毒陽性樣本,單純皰疹病毒工型陽性樣本,單純皰疹病毒II型陽性樣本,乙型肝炎陽性樣本,丙型肝炎陽性樣本各十例,以自制試劑檢測上述血清,觀察測定的陰陽性情況,評價檢測的交叉反應(yīng)性。2.2.3抗干擾性分析：陰性對照、陽性對照中加入一定量的甘油三酯、血紅蛋白和膽紅素,對其進行測定,判斷干擾情況。2.3試劑盒臨床性能評估2.3.1參考值范圍：以自制的EB病毒Zta蛋白IgA時間分辨熒光免疫分析試劑盒檢測445份健康人血清,統(tǒng)計血清熒光值的分布情況,計算樣本熒光值與陰性對照的比值。取涵蓋99%正常樣本的界值,初步確定為試劑盒的正常人參考值,再結(jié)合ROC曲線最終確定參考值范圍。2.3.2與對照試劑盒的比較：樣本用自制試劑盒和對照試劑盒同時對501份樣本進行檢測,對其陰性符合率和陽性符合率進行比較。結(jié)果：(一) EB病毒NAl IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑NA1抗原包被濃度確定為2.5μg/mL,銪標(biāo)記抗體稀釋比例為1：2000,反應(yīng)時間確定為60min。420份健康人血清測試結(jié)果顯示,當(dāng)樣本熒光值與陰性對照比值在2.7時,包含了99%以上的樣本；ROC曲線表明,當(dāng)比值在2.7時,敏感度為97.7%,特異性為95.5%；據(jù)此設(shè)定本試劑盒的EBNAl IgA抗體的cutoff值=陰性對照熒光值×2.7。分析內(nèi)和分析間精密度分別為1.56-4.99%和3.92-6.95%;與CMV、HSV Ⅰ型、HSV Ⅱ型、HBV、HCV無交叉反應(yīng)。干擾性實驗表明自制試劑盒不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。與中山生物公司研制的EB病毒核抗原(NA1) IgA抗體ELISA試劑盒比較,本試劑盒檢測的結(jié)果與中山生物公司的試劑盒檢測結(jié)果高度一致,說明本試劑能夠滿足臨床檢測的要求。(二) EB病毒Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑Zta抗原包被濃度確定為2.0μg/mL,銪標(biāo)記抗體稀釋比例為1：1000,反應(yīng)時間確定為60min。445份健康人血清測試結(jié)果顯示,當(dāng)樣本熒光值與陰性對照比值在3.1時,包含了99%以上的樣本；ROC曲線表明,當(dāng)比值在3.1時,敏感度為99.2%,特異性為93.6%；據(jù)此設(shè)定本試劑盒的Zta IgA抗體的cutoff值=陰性對照熒光值×3.1。分析內(nèi)和分析間精密度分別為2.45%-3.69%和3.80%-4.80%；與巨細(xì)胞病毒,單純皰疹病毒Ⅰ型,單純皰疹病毒Ⅱ型,乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒無交叉反應(yīng)。干擾性實驗表明自制試劑盒不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。與中山生物公司研制的EB病毒Zta蛋白IgA抗體ELISA試劑盒比較,對501份臨床樣本進行分析比較,本試劑盒檢測的結(jié)果與中山生物公司的試劑盒檢測結(jié)果高度一致,說明本試劑能夠滿足臨床檢測的要求。結(jié)論：以上結(jié)果表明,本研究研制的EB病毒核抗原(NA1)IgA、Zta IgA時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的各項指標(biāo)(精密度、特異性、干擾性等)均達(dá)到臨床檢測試劑要求,有望廣泛應(yīng)用于臨床樣本的檢測。
【關(guān)鍵詞】：時間分辨熒光免疫分析 EBNA1 IgA Zta IgA 鼻咽癌 檢測
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.63;R730.43
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-29
• 第一章 EB病毒核抗原(NA1)IgA抗體時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的研制29-53
• 1.1 材料29-30
• 1.2 方法30-35
• 1.3 結(jié)果35-49
• 1.4 討論49-52
• 1.5 結(jié)論52-53
• 第二章 EB病毒Zta蛋白IgA抗體時間分辨熒光免疫分析檢測試劑的研制53-75
• 2.1 材料53-54
• 2.2 方法54-59
• 2.3 結(jié)果59-72
• 2.4 討論72-74
• 2.5 結(jié)論74-75
• 參考文獻75-79
• 中英文縮略詞79-81
• 碩士期間論文發(fā)表情況81-82
• 致謝82-83

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王詠梅;曲熙波;;EB病毒引起肝臟損害110例臨床分析[J];傳染病信息;2006年03期

2 鄧洪,曾毅,雷一鳴,趙正寶,王培中,李秉均,皮至明,譚碧芳,鄭裕明,潘文俊,鐘正宜,伍覺炎;SEROLOGICAL SURVEY OF NASOPHARYNGEAL CARCINOMA IN 21 CITIES OF SOUTH CHINA[J];Chinese Medical Journal;1995年04期

，

本文編號：590500