本文關(guān)鍵詞：GTFⅡF2突變體與CLIC1蛋白的相互作用

  更多相關(guān)文章： GTFⅡF2 酵母雙雜交 免疫熒光 免疫共沉淀 RNA干擾

【摘要】：目的本文旨在研究證明GTFⅡF2突變體是否與CLIC1蛋白之間存在相互作用及GTFⅡF2的表達(dá)對食管癌細(xì)胞的增殖及遷移的影響,分別應(yīng)用了質(zhì)粒構(gòu)建、酵母雙雜交、間接免疫熒光、免疫印跡、GST pulldown、免疫共沉淀以及RNA干擾等實(shí)驗(yàn)技術(shù),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞、食管癌細(xì)胞或轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞加以證實(shí),為探索GTFⅡF2的功能及其突變體和CLIC1蛋白功能的關(guān)系奠定一定的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。方法根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求設(shè)計(jì)GTFIIF2突變體的上下游引物,利用PCR方法分別擴(kuò)增缺失突變體GTFⅡF2-N:GTFⅡF2-(1-165 aa);GTFⅡF2(1-100 aa);GTFⅡF2(1-142 aa)和GTFⅡF2-C:GTFⅡF2(161-249 aa);GTFⅡF2(101-249aa);GTFⅡF2(143-249 aa),將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送公司測序。在內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中,不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒,分別利用GTFⅡF2和CLIC1抗體孵育和瓊脂糖珠沉淀后,收集瓊脂糖珠珠子western blot分析GTFⅡF2與CLIC1蛋白之間是否相互影響。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)需要構(gòu)建GTFⅡF2突變體的酵母表達(dá)質(zhì)粒p GΑDT7-GTFⅡF2(1-165 aa),p GΑDT7-GTFⅡF2(161-249 aa),p GBKT7-GTFⅡF2(1-165 aa),p GBKT7-GTFⅡF2(161-249 aa),分別與實(shí)驗(yàn)室保存的p GBKT7-CLIC1,p GΑDT7-CLIC1共同轉(zhuǎn)化于酵母感受態(tài)細(xì)胞ΑH109中,并在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培養(yǎng)基上進(jìn)行營養(yǎng)篩選,對長出的酵母克隆使用X-α-gαl進(jìn)行活性測定,通過顏色篩選克隆是否變藍(lán)來證明GTFⅡF2(1-165 aa),GTFⅡF2(161-249 aa)是否與CLIC1存在相互作用。構(gòu)建GTFⅡF2各個(gè)突變體于pc DNA3.1和p CDGFP真核表達(dá)載體上,在間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)中,分別將pc DNΑ3.1-CLIC1-FLΑG和pc DGFP-GTFⅡF2突變體或者FLΑG-GTFⅡF2突變體和pc DGFP-CLIC1共同轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS7中,進(jìn)行免疫熒光制片,通過激光共聚焦觀察GTFⅡF2突變體是否與CLIC1存在共定位現(xiàn)象。在外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中,分別將pc DNΑ3.1-CLIC1-FLΑG和pc DGFP-GTFⅡF2突變體共同轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK 293T中,利用FLAG抗體孵育和瓊脂糖珠沉淀后,收集瓊脂糖珠珠子western blot分析。在GST pulldown中,分別將GFP標(biāo)簽的相關(guān)質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK 293T中與實(shí)驗(yàn)室保存的GST-CLIC1或者GSTGTFⅡF2突變體融合蛋白在體外混旋,收集谷胱甘肽珠子進(jìn)行western blot分析GTFⅡF2突變體是否與CLIC1存在相互作用。人工合成靶向GTFⅡF2基因的si RNA序列和陰性對照si RNA序列及質(zhì)粒pc DNA3.1-GTFⅡF2-FLAG,分別轉(zhuǎn)染至食管癌細(xì)胞中,采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察其對食管癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。結(jié)果限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定重組質(zhì)粒的結(jié)果和測序結(jié)果一致,證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)用GTFⅡF2抗體免疫印跡后,能夠檢測CLIC1蛋白的存在,當(dāng)用CLIC1抗體免疫印跡后,同樣能夠檢測GTFⅡF2蛋白的存在,說明二者存在相互作用。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明,分別表達(dá)了野生型GTFⅡF2與CLIC1和缺失突變體GTFⅡF2(1-165)與CLIC1蛋白的酵母細(xì)胞能夠在SD3-培養(yǎng)基中正常生長,并且酵母克隆在進(jìn)行α-半乳糖苷酶活性測定后顏色變藍(lán),證明二者存在相互作用;共同表達(dá)了GTFⅡF2(161-249)和CLIC1兩種蛋白的酵母細(xì)胞在SD3-培養(yǎng)基中不能夠正常生長并且進(jìn)行α-半乳糖苷酶活性測定后顏色沒有變化,說明二者不存在相互作用。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,FLAG-GTFⅡF2突變體與CLIC1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布,二者在細(xì)胞質(zhì)中的相同部位都有表達(dá)。GFP-GTFⅡF2-N在COS7細(xì)胞中主要分布于細(xì)胞質(zhì),與CLIC1蛋白無明顯定位,而GFP-GTFⅡF2-C細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均有分布,與CLIC1蛋白有明顯的共定位。外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示,當(dāng)用GFP抗體免疫印跡后,實(shí)驗(yàn)組GFP-GTFⅡF2突變體和CLIC1-FLΑG中能夠檢測到GFP-GTFⅡF2-N的存在,表明FLAG抗體在沉淀CLIC1-FLΑG的同時(shí)也將GFP-GTFⅡF2-N共同沉淀下來,即證明二者存在相互作用,并且相互作用的結(jié)構(gòu)域在(1-100 aa)。GST pulldown實(shí)驗(yàn)顯示,實(shí)驗(yàn)組GFP-CLIC1+GST-GTFⅡF2-N能夠檢測到GTFⅡF2-N的存在,表明GST-GTFⅡF2-N非GST-GTFⅡF2-C融合蛋白在體外條件下能夠下拉GFP-CLIC1;實(shí)驗(yàn)組GST-CLIC1+GFP-GTFⅡF2突變體能夠檢測到GTFⅡF2-N的存在,表明GST-CLIC1融合蛋白在體外條件下能夠下拉GTFⅡF2-N,則初步證明GTFⅡF2蛋白與CLIC1蛋白存在相互作用的結(jié)構(gòu)域在(1-100 aa)。RNA干擾技術(shù)靶向沉默GTFⅡF2基因表達(dá)后,食管癌細(xì)胞的增殖和遷移均明顯受到了抑制,而過表達(dá)GTFⅡF2對食管癌細(xì)胞的增殖和遷移沒有明顯的影響。結(jié)論內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)在GTFⅡF2與CLIC1相互作用,并且通過酵母雙雜交、免疫共沉淀、GST pulldown、間接免疫熒光等四種實(shí)驗(yàn)技術(shù)充分證明了GTFⅡF2-N和CLIC1蛋白在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中都存在相互作用,而且相互作用的結(jié)構(gòu)域是在N端前100個(gè)氨基酸范圍內(nèi)。Knockdown GTFⅡF2抑制了食管癌細(xì)胞TE-1、ECA-109的增殖和遷移,為探索GTFⅡF2的功能及其突變體和CLIC1蛋白功能的關(guān)系奠定一定的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：GTFⅡF2 酵母雙雜交 免疫熒光 免疫共沉淀 RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R735.1
【目錄】：

• 英文縮略表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 1 引言14-17
• 2 材料與方法17-45
• 3 結(jié)果45-67
• 4 討論67-70
• 5 結(jié)論70-71
• 6 對本課題的進(jìn)一步設(shè)想71-72
• 7 參考文獻(xiàn)72-77
• 附錄77-79
• 致謝79-80
• 綜述80-91
• 參考文獻(xiàn)86-91

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本文編號：589229