本文關(guān)鍵詞：納米金棒-MUC1適配體復(fù)合物的構(gòu)建及其靶向識(shí)別研究

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【摘要】：【研究背景】肺癌是危害人類生命健康的常見疾病,其發(fā)病率和死亡率高居常見腫瘤之首。大部分肺癌患者因癥狀不明顯,發(fā)現(xiàn)時(shí)多已進(jìn)展至晚期,傳統(tǒng)放療、化療等手段治療效果不佳,新興的靶向藥物及免疫調(diào)定點(diǎn)阻滯劑在肺癌患者治療中表現(xiàn)出持續(xù)獲益,但均存在其局限性,在肺癌的診斷及治療領(lǐng)域要有新的突破需尋求新的靶向治療策略。納米金棒(AuNRs)具有獨(dú)特的生物相容性、表面修飾和功能化、高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention,EPR)、表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)、光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)等理化及生物性質(zhì),在腫瘤診斷和治療領(lǐng)域展示出巨大應(yīng)用前景,通常將表面修飾的AuNRs結(jié)合靶向分子構(gòu)建具有主動(dòng)靶向功能的AuNRs復(fù)合載體廣泛應(yīng)用于分子成像、靶向載藥、放療增敏、光熱治療等腫瘤診斷及治療領(lǐng)域。核酸適配體是一種通過(guò)指數(shù)級(jí)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中逐層篩選擴(kuò)增出的能特異性與靶標(biāo)結(jié)合的小片段DNA或RNA,與傳統(tǒng)抗體相比,具有高親和性、免疫原性弱、易于大規(guī)模合成、易于體外修飾、易于穿透腫瘤組織等性質(zhì),成為理想的靶標(biāo)分子。黏蛋白-1(Mucin-1,MUC1)是一種分布在呼吸道、腺體導(dǎo)管、胃腸道等上皮細(xì)胞表面的高度糖基化黏蛋白,研究已表明它與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞遷移等過(guò)程密切相關(guān),發(fā)生癌變時(shí)在細(xì)胞表面異常高表達(dá),且暴露其核心肽上的相關(guān)抗原表位,使其成為一種廣譜靶標(biāo)分子。為充分發(fā)揮AuNRs和核酸適配子的高效性,可考慮通過(guò)SELEX技術(shù)篩選出能與肺癌細(xì)胞表面高表達(dá)的MUC1蛋白具有高度親和性的MUC1適配體(MUC1-aptamer),并將MUC1適配體與表面修飾的AuNRs連接構(gòu)建一種新的具有主動(dòng)靶向功能的復(fù)合物,應(yīng)用于肺癌的早期診斷及治療領(lǐng)域的研究,探究肺癌細(xì)胞對(duì)這種復(fù)合物的攝取機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行靶向藥物運(yùn)載、在人體組織投射窗口予近紅外激光照射等相關(guān)的靶向殺傷研究,以期為肺癌的新型靶向診療平臺(tái)提供理論基礎(chǔ),為肺癌的早期診斷和治療提供新的思路�！狙芯磕康摹�1.如何通過(guò)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件,調(diào)節(jié)納米金粒子縱橫比以合成在525nm和近800nm波長(zhǎng)處具有雙spr峰的aunrs;2.篩選并合成能與肺癌a549細(xì)胞系表面高表達(dá)的muc1蛋白具有高度親和的muc1-aptamer;3.在成功合成前兩步目標(biāo)物質(zhì)基礎(chǔ)上構(gòu)建具有主動(dòng)靶向功能的aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物;4.探究所構(gòu)建的新型靶向aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物與高表達(dá)muc1蛋白的肺癌a549細(xì)胞系結(jié)合、攝取特點(diǎn),對(duì)比納米金棒被動(dòng)靶向性的優(yōu)勢(shì)所在;5.探究給予人體組織投射窗口的近紅外激光照射對(duì)靶向結(jié)合aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物的a549細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)�！狙芯糠椒ā�1.改變agno3、ctab、抗壞血酸(ascorbicacid,aa)的濃度,調(diào)整納米金粒子縱橫比,通過(guò)金種子法誘導(dǎo)生長(zhǎng)法(seed-mediatedgrowthmethods)合成在525nm和近800nm波長(zhǎng)處具有雙向spr峰的aunrs,并進(jìn)一步通過(guò)紫外分光法測(cè)定驗(yàn)證,所得aunrs置于4℃保存?zhèn)溆?2.選取對(duì)muc1蛋白核心肽具有高親和性的適配體s2.2作為目標(biāo)muc1核酸適配體,并在單鏈muc1-aptamer的5’端修飾巰基以結(jié)合aunrs,在3’端修飾6’-fam熒光基團(tuán)作為特異性結(jié)合靶細(xì)胞的檢測(cè)標(biāo)記,通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)驗(yàn)證合成目標(biāo)適配體的序列正確性及純度;3.通過(guò)納米金棒的快速修飾法(rapidmodificationatlowph,rmlp)高效快速地將合成的巰基化muc1-aptamer修飾連接aunrs,并使用納米金比色法、紫外分光法對(duì)所構(gòu)建的aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物的物理特性進(jìn)行表征及驗(yàn)證;4.將所構(gòu)建的aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物分別與傳代培養(yǎng)的肺癌a549細(xì)胞系及對(duì)照組肝癌hepg2細(xì)胞系孵育,流式細(xì)胞儀檢測(cè)及熒光顯微鏡觀察復(fù)合物與細(xì)胞的靶向結(jié)合與攝入,細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度代表靶向復(fù)合物結(jié)合細(xì)胞的效率;5.利用aunrs的近紫外區(qū)吸收峰及光熱轉(zhuǎn)換特性,使用近紅外光分別對(duì)與aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物和aunrs孵育后的靶細(xì)胞進(jìn)行照射,并使用mtt比色法檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng),細(xì)胞存活率的大小與其孵育的藥物毒性相關(guān)�！窘Y(jié)果】金種子誘導(dǎo)生長(zhǎng)法所合成納米金棒通過(guò)紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)其紫外吸收波譜,在波長(zhǎng)525nm和近800nm近紅外光處可見雙重等離子共振峰,即為目標(biāo)所需AuNRs;將合成的巰基化MUC1-aptamer通過(guò)快速修飾法對(duì)AuNRs進(jìn)行修飾,合成AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物,通過(guò)納米金的比色法和紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)紫外吸收波譜,可知靶向復(fù)合物構(gòu)建成功,且該靶向復(fù)合物在波長(zhǎng)525nm和近800nm近紅外光處仍有可見雙重等離子共振峰;構(gòu)建的AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物與A549細(xì)胞孵育后使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度顯著高于其他各組,同時(shí)使用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度,其熒光強(qiáng)度是AuNRs處理對(duì)照組5倍,差異顯著,在肝癌HepG2細(xì)胞系未見明顯差異,認(rèn)為構(gòu)建的靶向復(fù)合物與肺癌A549細(xì)胞系表現(xiàn)為特異性結(jié)合;分別與AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物、AuNRs孵育的靶細(xì)胞經(jīng)近紅外光照射后,MTT比色法測(cè)定吸光值并算出各組細(xì)胞存活率,得出靶向復(fù)合物組+A549細(xì)胞組較陰性對(duì)照組及HepG2細(xì)胞系對(duì)照組細(xì)胞存活率明顯降低,差異顯著(P0.05)�！窘Y(jié)論】綜合分析本課題各部分結(jié)果得出:本研究成功構(gòu)建了基于AuNRs和MUC1-aptamer結(jié)合的AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物,該靶向復(fù)合物具有AuNRs的物理化學(xué)特性和適配子的靶向性,并能對(duì)細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)MUC1蛋白的肺癌A549細(xì)胞系進(jìn)行靶向識(shí)別,近紅外光照射能對(duì)靶向結(jié)合AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物的A549細(xì)胞具有特異性殺傷作用,這種構(gòu)建的靶向復(fù)合物可為肺癌的靶向診療提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：納米金棒 核酸適配體 MUC1蛋白 肺癌 靶向治療
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-19
• 1.1 肺癌危害及診治現(xiàn)狀12-13
• 1.2 納米金棒特性及靶向應(yīng)用前景13-17
• 1.2.1 生物相容性13
• 1.2.2 表面修飾和功能化13-14
• 1.2.3 金納米棒靶向性14-16
• 1.2.4 表面等離子共振16
• 1.2.5 光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)16-17
• 1.3 MUC1適配體作為主動(dòng)靶向分子17
• 1.4 納米金棒-適配體靶向復(fù)合物的應(yīng)用17-18
• 1.5 本研究概述18-19
• 1.5.1 研究設(shè)計(jì)思路18
• 1.5.2 本研究創(chuàng)新點(diǎn)18
• 1.5.3 技術(shù)路線18-19
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法19-29
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器19-21
• 2.1.1 細(xì)胞株19
• 2.1.2 主要試劑19-20
• 2.1.3.主要試劑配方20
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-29
• 2.2.1 納米金棒的制備及性質(zhì)21-23
• 2.2.2 MUC1適配子的選擇與合成23-24
• 2.2.3 納米金棒與MUC1核酸適配子的制備24-25
• 2.2.4 A549/HepG2細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 2.2.5 結(jié)合靶向復(fù)合物細(xì)胞表面熒光檢測(cè)26-27
• 2.2.6 近紅外光對(duì)結(jié)合AuNRs/MUC1-aptamer細(xì)胞的靶向殺傷27-29
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析29
• 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-35
• 3.1 納米金棒特征29-30
• 3.2 巰基化的MUC1適配體S2.2 的合成及質(zhì)譜檢測(cè)30
• 3.3 納米金棒與MUC1核酸適配體的制備30-32
• 3.4 結(jié)合靶向復(fù)合物細(xì)胞表面熒光檢測(cè)32-33
• 3.5 新型靶向復(fù)合物對(duì)靶細(xì)胞的靶向殺傷33-35
• 4.討論35-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-47
• 常用英文縮略詞表47-48
• 已發(fā)表綜述 納米金應(yīng)用于肺癌靶向診療的研究進(jìn)展48-58
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文58-59
• 致謝59-60

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