本文關(guān)鍵詞：納米金棒-MUC1適配體復(fù)合物的構(gòu)建及其靶向識別研究

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【摘要】：【研究背景】肺癌是危害人類生命健康的常見疾病,其發(fā)病率和死亡率高居常見腫瘤之首。大部分肺癌患者因癥狀不明顯,發(fā)現(xiàn)時多已進展至晚期,傳統(tǒng)放療、化療等手段治療效果不佳,新興的靶向藥物及免疫調(diào)定點阻滯劑在肺癌患者治療中表現(xiàn)出持續(xù)獲益,但均存在其局限性,在肺癌的診斷及治療領(lǐng)域要有新的突破需尋求新的靶向治療策略。納米金棒(AuNRs)具有獨特的生物相容性、表面修飾和功能化、高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention,EPR)、表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)、光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)等理化及生物性質(zhì),在腫瘤診斷和治療領(lǐng)域展示出巨大應(yīng)用前景,通常將表面修飾的AuNRs結(jié)合靶向分子構(gòu)建具有主動靶向功能的AuNRs復(fù)合載體廣泛應(yīng)用于分子成像、靶向載藥、放療增敏、光熱治療等腫瘤診斷及治療領(lǐng)域。核酸適配體是一種通過指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)從隨機單鏈核酸序列庫中逐層篩選擴增出的能特異性與靶標結(jié)合的小片段DNA或RNA,與傳統(tǒng)抗體相比,具有高親和性、免疫原性弱、易于大規(guī)模合成、易于體外修飾、易于穿透腫瘤組織等性質(zhì),成為理想的靶標分子。黏蛋白-1(Mucin-1,MUC1)是一種分布在呼吸道、腺體導(dǎo)管、胃腸道等上皮細胞表面的高度糖基化黏蛋白,研究已表明它與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞生長、腫瘤細胞遷移等過程密切相關(guān),發(fā)生癌變時在細胞表面異常高表達,且暴露其核心肽上的相關(guān)抗原表位,使其成為一種廣譜靶標分子。為充分發(fā)揮AuNRs和核酸適配子的高效性,可考慮通過SELEX技術(shù)篩選出能與肺癌細胞表面高表達的MUC1蛋白具有高度親和性的MUC1適配體(MUC1-aptamer),并將MUC1適配體與表面修飾的AuNRs連接構(gòu)建一種新的具有主動靶向功能的復(fù)合物,應(yīng)用于肺癌的早期診斷及治療領(lǐng)域的研究,探究肺癌細胞對這種復(fù)合物的攝取機制,并在此基礎(chǔ)上進行靶向藥物運載、在人體組織投射窗口予近紅外激光照射等相關(guān)的靶向殺傷研究,以期為肺癌的新型靶向診療平臺提供理論基礎(chǔ),為肺癌的早期診斷和治療提供新的思路�！狙芯磕康摹�1.如何通過嚴格控制實驗條件,調(diào)節(jié)納米金粒子縱橫比以合成在525nm和近800nm波長處具有雙spr峰的aunrs;2.篩選并合成能與肺癌a549細胞系表面高表達的muc1蛋白具有高度親和的muc1-aptamer;3.在成功合成前兩步目標物質(zhì)基礎(chǔ)上構(gòu)建具有主動靶向功能的aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物;4.探究所構(gòu)建的新型靶向aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物與高表達muc1蛋白的肺癌a549細胞系結(jié)合、攝取特點,對比納米金棒被動靶向性的優(yōu)勢所在;5.探究給予人體組織投射窗口的近紅外激光照射對靶向結(jié)合aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物的a549細胞的特異性殺傷效應(yīng)。【研究方法】1.改變agno3、ctab、抗壞血酸(ascorbicacid,aa)的濃度,調(diào)整納米金粒子縱橫比,通過金種子法誘導(dǎo)生長法(seed-mediatedgrowthmethods)合成在525nm和近800nm波長處具有雙向spr峰的aunrs,并進一步通過紫外分光法測定驗證,所得aunrs置于4℃保存?zhèn)溆?2.選取對muc1蛋白核心肽具有高親和性的適配體s2.2作為目標muc1核酸適配體,并在單鏈muc1-aptamer的5’端修飾巰基以結(jié)合aunrs,在3’端修飾6’-fam熒光基團作為特異性結(jié)合靶細胞的檢測標記,通過質(zhì)譜檢測驗證合成目標適配體的序列正確性及純度;3.通過納米金棒的快速修飾法(rapidmodificationatlowph,rmlp)高效快速地將合成的巰基化muc1-aptamer修飾連接aunrs,并使用納米金比色法、紫外分光法對所構(gòu)建的aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物的物理特性進行表征及驗證;4.將所構(gòu)建的aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物分別與傳代培養(yǎng)的肺癌a549細胞系及對照組肝癌hepg2細胞系孵育,流式細胞儀檢測及熒光顯微鏡觀察復(fù)合物與細胞的靶向結(jié)合與攝入,細胞表面熒光強度代表靶向復(fù)合物結(jié)合細胞的效率;5.利用aunrs的近紫外區(qū)吸收峰及光熱轉(zhuǎn)換特性,使用近紅外光分別對與aunrs/muc1-aptamer復(fù)合物和aunrs孵育后的靶細胞進行照射,并使用mtt比色法檢測對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng),細胞存活率的大小與其孵育的藥物毒性相關(guān)�！窘Y(jié)果】金種子誘導(dǎo)生長法所合成納米金棒通過紫外分光光度計法檢測其紫外吸收波譜,在波長525nm和近800nm近紅外光處可見雙重等離子共振峰,即為目標所需AuNRs;將合成的巰基化MUC1-aptamer通過快速修飾法對AuNRs進行修飾,合成AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物,通過納米金的比色法和紫外分光光度計法檢測紫外吸收波譜,可知靶向復(fù)合物構(gòu)建成功,且該靶向復(fù)合物在波長525nm和近800nm近紅外光處仍有可見雙重等離子共振峰;構(gòu)建的AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物與A549細胞孵育后使用熒光顯微鏡觀察細胞表面熒光強度顯著高于其他各組,同時使用流式細胞儀定量檢測細胞表面熒光強度,其熒光強度是AuNRs處理對照組5倍,差異顯著,在肝癌HepG2細胞系未見明顯差異,認為構(gòu)建的靶向復(fù)合物與肺癌A549細胞系表現(xiàn)為特異性結(jié)合;分別與AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物、AuNRs孵育的靶細胞經(jīng)近紅外光照射后,MTT比色法測定吸光值并算出各組細胞存活率,得出靶向復(fù)合物組+A549細胞組較陰性對照組及HepG2細胞系對照組細胞存活率明顯降低,差異顯著(P0.05)。【結(jié)論】綜合分析本課題各部分結(jié)果得出:本研究成功構(gòu)建了基于AuNRs和MUC1-aptamer結(jié)合的AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物,該靶向復(fù)合物具有AuNRs的物理化學(xué)特性和適配子的靶向性,并能對細胞表面過表達MUC1蛋白的肺癌A549細胞系進行靶向識別,近紅外光照射能對靶向結(jié)合AuNRs/MUC1-aptamer復(fù)合物的A549細胞具有特異性殺傷作用,這種構(gòu)建的靶向復(fù)合物可為肺癌的靶向診療提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：納米金棒 核酸適配體 MUC1蛋白 肺癌 靶向治療
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-19
• 1.1 肺癌危害及診治現(xiàn)狀12-13
• 1.2 納米金棒特性及靶向應(yīng)用前景13-17
• 1.2.1 生物相容性13
• 1.2.2 表面修飾和功能化13-14
• 1.2.3 金納米棒靶向性14-16
• 1.2.4 表面等離子共振16
• 1.2.5 光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)16-17
• 1.3 MUC1適配體作為主動靶向分子17
• 1.4 納米金棒-適配體靶向復(fù)合物的應(yīng)用17-18
• 1.5 本研究概述18-19
• 1.5.1 研究設(shè)計思路18
• 1.5.2 本研究創(chuàng)新點18
• 1.5.3 技術(shù)路線18-19
• 2 實驗材料與方法19-29
• 2.1 主要實驗試劑與儀器19-21
• 2.1.1 細胞株19
• 2.1.2 主要試劑19-20
• 2.1.3.主要試劑配方20
• 2.1.4 主要實驗儀器與設(shè)備20-21
• 2.2 實驗方法21-29
• 2.2.1 納米金棒的制備及性質(zhì)21-23
• 2.2.2 MUC1適配子的選擇與合成23-24
• 2.2.3 納米金棒與MUC1核酸適配子的制備24-25
• 2.2.4 A549/HepG2細胞培養(yǎng)25-26
• 2.2.5 結(jié)合靶向復(fù)合物細胞表面熒光檢測26-27
• 2.2.6 近紅外光對結(jié)合AuNRs/MUC1-aptamer細胞的靶向殺傷27-29
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)分析29
• 3.實驗結(jié)果29-35
• 3.1 納米金棒特征29-30
• 3.2 巰基化的MUC1適配體S2.2 的合成及質(zhì)譜檢測30
• 3.3 納米金棒與MUC1核酸適配體的制備30-32
• 3.4 結(jié)合靶向復(fù)合物細胞表面熒光檢測32-33
• 3.5 新型靶向復(fù)合物對靶細胞的靶向殺傷33-35
• 4.討論35-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-47
• 常用英文縮略詞表47-48
• 已發(fā)表綜述 納米金應(yīng)用于肺癌靶向診療的研究進展48-58
• 參考文獻54-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文58-59
• 致謝59-60

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本文編號：589114