本文關(guān)鍵詞：HCV核心蛋白對人Huh7肝癌細(xì)胞mRNA，lncRNA和circRNA表達(dá)的影響及其致癌機(jī)制初探

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【摘要】：研究背景：丙型肝炎病毒(HCV)與慢性肝炎,肝硬化和原發(fā)性肝癌(HCC)的形成密切相關(guān)。核心蛋白作為構(gòu)成HCV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白,是HCV最重要的成分之一,其參與了包括HCV的免疫逃逸,因HCV感染導(dǎo)致的肝纖維化和HCC等肝臟疾病和抵抗藥物治療等過程。HCC作為一種高致死率的惡性腫瘤,近年來發(fā)病率持續(xù)升高,而細(xì)胞周期異常,凋亡抵抗和癌基因及相關(guān)通路的激活是其發(fā)生的主要分子機(jī)制。非編碼RNA (ncRNA)是不編碼蛋白質(zhì)的RNA的總稱,其中的長非編碼RNA (lncRNA)是近年來生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容,其參與了生物生長發(fā)育和包括HCC在內(nèi)的諸多疾病發(fā)病過程。新近發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA(circRNA)由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和具有的如吸附miRNA以及參與癌癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)信號(hào)通路等生物學(xué)功能,得到了越來越多的關(guān)注。已報(bào)道發(fā)現(xiàn),有l(wèi)ncRNA參與到了乙型肝炎病毒(HBV)導(dǎo)致的肝癌中,例如HBV的HBx蛋白能下調(diào)lncRNA-Dreh從而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。但HCV或者其核心蛋白通過調(diào)控lncRNA分子導(dǎo)致HCC的研究卻極為鮮見,考慮到HCV與HBV的相似性,可以推測HCV或者HCV核心蛋白導(dǎo)致HCC的過程中可能有l(wèi)ncRNA分子的參與。此外,circRNA在疾病診斷和治療中的具有巨大的研究與應(yīng)用前景,基于以上研究背景,本研究開展了如下工作：研究目的：以HCVIb基因型核心蛋白作為研究對象,探討HCV核心蛋白對人Huh7肝癌細(xì)胞nRNA、lncRNA(?)circRNA表達(dá)的影響的研究,并初步分析HCV核心蛋白導(dǎo)致的HCC致癌的相關(guān)分子機(jī)制。研究方法：構(gòu)建重組表達(dá)載體PEGFP-Core (HCV核心蛋白為基因型為lb),將該重組表達(dá)載體和空載體PEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,經(jīng)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株并用RT-PCR檢測核心蛋白的表達(dá)。在抽提RNA后通過lncRNA芯片和環(huán)狀RNA(circRNA)芯片分析得到HCV核心蛋白表達(dá)對Huh7細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響情況。隨后找出表達(dá)差異2.0的lncRNA分子和circRNA分子,通過生物信息學(xué)分析,找出這些變化的分子與相關(guān)生理病理改變的關(guān)聯(lián)性；并同時(shí)結(jié)合閱讀文獻(xiàn)和利用相關(guān)分子靶位點(diǎn)預(yù)測平臺(tái),挑選相關(guān)基因并給出預(yù)測的可能致癌通路,對其中的相關(guān)基因的差異表達(dá)情況進(jìn)qPCR驗(yàn)證,最后通過構(gòu)建相關(guān)相關(guān)基因的重組表達(dá)載體并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh7-core細(xì)胞克隆,從而進(jìn)一步對相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行探究。研究結(jié)果：LncRNA芯片包含兩個(gè)部分,其中l(wèi)ncRNA檢測部分含有30586個(gè)基因位點(diǎn),mRNA檢測部分含有26109個(gè)基因位點(diǎn)。結(jié)果顯示,與對照組相比,有4851個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)和3569個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)超過2倍；4785個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)和3192個(gè)1nRNA表達(dá)下調(diào)超過對照組基因表達(dá)2倍。CircRNA芯片(含有5396個(gè)位點(diǎn)),分別發(fā)現(xiàn)了823個(gè)基因表達(dá)上調(diào)和419個(gè)基因表達(dá)下調(diào)超過對照組基因表達(dá)2倍。通過聚類分析和GO分析發(fā)現(xiàn),這些分子參與了包擴(kuò)細(xì)胞內(nèi)大分子代謝,核酸代謝等代謝過程以及DNA損傷反應(yīng),鈣離子通道調(diào)控等生化反應(yīng)。通過KEGG Pathway分析,這些分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,凋亡,鈣離子信號(hào)途徑,Wnt信號(hào)途徑,HBV, HCV感染等信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)。此外經(jīng)過qPCR驗(yàn)證了預(yù)測的信號(hào)通路中高表達(dá)或低表達(dá)的10個(gè)相關(guān)分子。最后通過構(gòu)建信號(hào)通路中的相關(guān)分子(miR122, miR192, miR204)的基因表達(dá)載體,探討了其表達(dá)對通路中其它分子可能的調(diào)控作用。結(jié)論：miR204-HPCALl, HOTTIP-GLS,和Circ0001498-miR122-TGFBRAP1這兩條信號(hào)通路可能與HCVlb基因型核心蛋白參與HCV感染所致的HCC相關(guān)過程存在關(guān)聯(lián)。
【關(guān)鍵詞】：HCV核心蛋白 原發(fā)性肝癌 RNA芯片 lncRNA circRNA
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要英文縮略詞9-11
• 前言11-13
• 綜述13-38
• 文獻(xiàn)綜述(一) HCV核心蛋白與與肝細(xì)胞癌研究進(jìn)展13-23
• 文獻(xiàn)綜述(二) 非編碼RNA與肝細(xì)胞癌研究近況23-28
• 參考文獻(xiàn)28-38
• 第一節(jié) 穩(wěn)定表達(dá)HCV核心蛋白Huh7細(xì)胞克隆的篩選及基因表達(dá)譜分析38-67
• 前言38-39
• 1 材料和試劑39-40
• 2 實(shí)驗(yàn)方法40-54
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-62
• 4 討論62-65
• 小結(jié)與展望65-66
• 參考文獻(xiàn)66-67
• 第二節(jié) HCV1b基因型核心蛋白在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)的致癌機(jī)制初探67-83
• 前言67-68
• 1 材料和試劑68-69
• 2 實(shí)驗(yàn)方法69-74
• 3 結(jié)果74-78
• 4 討論78-80
• 5 小結(jié)與展望80-81
• 參考文獻(xiàn)81-83
• 致謝83-84
• 作者簡介84

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 Min Li;Qi Wang;Shun-Ai Liu;Jin-Qian Zhang;Wei Ju;Min Quan;Sheng-Hu Feng;Jin-Ling Dong;Ping Gao;Jun Cheng;;MicroRNA-185-5p mediates regulation of SREBP2 expression by hepatitis C virus core protein[J];World Journal of Gastroenterology;2015年15期

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本文編號(hào)：561633