本文關(guān)鍵詞：miR-203和瘦素在卵巢癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： miR-203 瘦素 間葉細(xì)胞向上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 卵巢癌

【摘要】：卵巢癌(ovarian cancer)是嚴(yán)重危害婦女健康的三大癌癥之一,發(fā)生率居婦科惡性腫瘤的第三位,其較高的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率決定了卵巢癌有著很高的死亡率,探索和發(fā)現(xiàn)卵巢癌的生物標(biāo)記物對于卵巢癌的早期篩查、診斷、化療及預(yù)后等方面有重要意義。miRNAs,是一類小分子未編碼的RNA,在各式各樣的人類腫瘤中,通過抑制基因表達(dá)或降解mRNA以及抑制蛋白質(zhì)的合成和功能來發(fā)揮抑癌或促進(jìn)癌癥的作用。miRNAs在人類癌癥中的意義近年來也引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,在過去的十多年里,microRNA在人類癌癥中已被廣泛研究,他不僅可以作為癌基因也可作為抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。MicroRNA可以用于早期癌癥檢測和干預(yù)癌癥治療,但是有關(guān)miRNAs在人卵巢癌分子機(jī)制水平上的探索尚少。有報道指出,miR-203在肺癌、前列腺癌和乳腺癌中作為一個抑癌基因發(fā)揮抑癌作用,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。然而miR-203在卵巢癌中的作用仍不十分清楚,因此,我們設(shè)想在卵巢癌中miR-203也參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過程,本研究中我們試圖分析miR-203在卵巢癌中的作用以及其分子生物學(xué)機(jī)制,為卵巢癌的診斷、治療和預(yù)后尋求新的靶點。瘦素是OB,脂肪因子。是1個16個氨基酸殘基,146KDa的蛋白質(zhì)的一種類激素�；虮磉_(dá)瘦素,在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮多種功能,在人體中參與腫瘤發(fā)生。生物學(xué)功能方面,卵巢組織中有微量表達(dá)。卵巢癌組織瘦素表達(dá)上調(diào)。但是目前在卵巢癌中,瘦素的生物學(xué)功能和作用機(jī)制鮮有報道。因此本研究中我們設(shè)想在卵巢癌病人的血清、尿液與腫瘤組織中瘦素的表達(dá)同樣升高。目的1.體外實驗研究mir-203對卵巢癌細(xì)胞的影響,分析過表達(dá)mir-203及沉默其目標(biāo)基因的表達(dá)后在卵巢癌中發(fā)揮的作用,為卵巢癌的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。2.動物實驗,通過對小鼠病理標(biāo)本中mir-203的表達(dá)研究mir-203的體內(nèi)效應(yīng),探索其作為卵巢癌診斷指標(biāo)的可行性。3.對卵巢癌患者的病理組織內(nèi)mir-203的表達(dá)進(jìn)行分析,以期發(fā)現(xiàn)mir-203在卵巢癌的臨床篩查,早期診斷,治療及預(yù)后等方面的生物標(biāo)記潛能。4.通過對卵巢癌患者血清,尿液以及腫瘤組織中瘦素的表達(dá)水平分析其在卵巢癌中發(fā)揮的功能,探索瘦素作為臨床診斷卵巢癌生物標(biāo)記物的可能性。材料和方法1.研究對象:細(xì)胞株:skov3和ovcar3細(xì)胞系均來自美國菌種保存中心。病例:20例人卵巢癌標(biāo)本和20例正常卵巢癌組織來自美國田納西州孟菲斯西南癌癥醫(yī)院,來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和第三附屬醫(yī)院的手術(shù)標(biāo)本60例.2.研究方法:(1)蛋白印跡法檢測mir-203過表達(dá)后的emt標(biāo)記蛋白的表達(dá)情況以及臨床標(biāo)本中瘦素的表達(dá):將導(dǎo)入空載體和mir-203的skov3和ovcar3細(xì)胞培養(yǎng)至80%密度,收集細(xì)胞,洗滌,裂解細(xì)胞膜并收取蛋白,采用蛋白印跡法檢測細(xì)胞e-cadherin,vimentin和snial2的表達(dá)水平,以gapdh為內(nèi)參對照。同樣的方法檢測卵巢腫瘤組織中瘦素蛋白的表達(dá)水平。(2)mtt和細(xì)胞克隆集落形成實驗研究細(xì)胞生長增殖速度mtt:在96孔板上,種植2000個細(xì)胞每孔。分別培養(yǎng)24,48,72和96小時后,每孔加入10μl的mtt反應(yīng)劑,培養(yǎng)4個小時。然后輕輕倒出加了mtt的培養(yǎng)液,每孔加入200微升的細(xì)胞凍存液,搖床震蕩10分鐘,避光。利用多功能酶標(biāo)儀在570nm波長處測定其吸光度。細(xì)胞集落實驗:實驗組和對照組細(xì)胞按每孔300個細(xì)胞接種于6孔板上,每5天換液一次,2周后用結(jié)晶紫固定染色,分析比較兩組細(xì)胞克隆集落大小及數(shù)目。(4)細(xì)胞遷移能力分析1x104個卵巢癌細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng),細(xì)胞種在小室上,下室dmem培養(yǎng)液加入含fbs的dmem,培養(yǎng)5個小時。用棉簽拭去小室上層細(xì)胞,甲醇固定15分鐘,再用結(jié)晶紫染色30分鐘,最后熒光顯微鏡下照相,比較兩組細(xì)胞的遷移能力。(5)細(xì)胞侵襲能力分析1x105個卵巢癌細(xì)胞種在覆蓋有基底膜的小室上,用不含fbs的dmem培養(yǎng),下室為有血清的營養(yǎng)液,連續(xù)培養(yǎng)24小時之后,拭去上小室的細(xì)胞,甲醇固定15分鐘,緊接著結(jié)晶紫染色30分鐘,用棉簽擦掉小室上層細(xì)胞,照相,計數(shù)。比較兩組細(xì)胞的invasion能力。(6)caspase3/7檢測藥物誘導(dǎo)的空載體轉(zhuǎn)染和mir203過表達(dá)后skov3、ovcar3兩種細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡capases3/7細(xì)胞凋亡:三孔重復(fù),準(zhǔn)備好測量熒光強度的測量系統(tǒng)和反應(yīng)試劑盒。在96孔板上,種上8000個卵巢癌細(xì)胞,培養(yǎng)過夜,接著在無血清的條件下,血清饑餓一個小時。用不同濃度的化療藥物處理細(xì)胞,繼續(xù)37度連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24個小時,最后用caspase3/7檢測,24小時后細(xì)胞的凋亡。(7)動物實驗:選用3~4周左右的雌性nsg小鼠10只并檢測健康狀況,注射細(xì)胞,建立模型。5×106skov3和mir203過表達(dá)的skov3、ovcar3細(xì)胞系小鼠皮下注射,每天檢查,每組5只。持續(xù)8周。兩個月后,處死小鼠,測量腫瘤數(shù)量及重量。(8)免疫熒光法檢測卵巢癌患者癌組織中snial2和e-cadherin,vimentin的表達(dá)情況:收集卵巢癌和正常卵巢組織,制作石蠟組織切片,對snial2、e-cadherin和vimentin進(jìn)行免疫熒光染色,熒光顯微鏡下拍照。(9)rt-pcr即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng):提取空載體轉(zhuǎn)染和mir203過表達(dá)的skov3和ovcar3細(xì)胞中的rna以及卵巢腫瘤組織中的rna,反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna,再用相應(yīng)的primerpcr擴(kuò)增,分析兩種細(xì)胞系中mir203的表達(dá)水平以及瘦素的表達(dá)水平。(10)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)檢測血清和尿液中瘦素水平:將需要檢測的抗原溶液加入96孔板中,待其充分貼壁后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。在96孔板中的每個孔中加入非反應(yīng)蛋白溶液,將沒有完全覆蓋好抗原的板底覆蓋。加入特異性的一抗和連接酶至覆蓋住孔。然后加酶,底物的顏色會隨之而變。一抗?jié)舛仍礁?則反應(yīng)的就越大。同時,也可以用分光儀對顏色的改變進(jìn)行測量。酶的作用可以增強反應(yīng)的效果,即使很少量的酶鏈抗體都可以產(chǎn)生多種生物信號。由于認(rèn)識的局限性,雖然酶可以產(chǎn)生出不同的顏色,但是抗體越多,顏色的改變就越快。elisa的主要缺點是缺乏特異性的抗體�？贵w顯色后在492nm波長處測量其免疫熒光強度,tmb反應(yīng)產(chǎn)物需要在450nm波長出檢測其強度。3.統(tǒng)計學(xué)方法:采用spss17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。應(yīng)用c2檢驗及精確概率法比較不同卵巢組織中mir-203和瘦素的陽性表達(dá)率,檢驗水準(zhǔn)α=0.05,mir-203表達(dá)和正常對照卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞功能分析用方差t檢驗,p0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果1.mir-203在卵巢癌患者組織中表達(dá)異常并且和卵巢癌病人的長期存活率有關(guān)。2.snail2在人卵巢癌中表達(dá)上調(diào)并且與卵巢癌病人的短期存活率有關(guān)。3.離體培養(yǎng)ovcar3,skov3細(xì)胞中,mir-203抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,增強細(xì)胞對順鉑的敏感性。4.mir-203在卵巢癌細(xì)胞系中通過抑制基因snail2的表達(dá)抑制emt,并且可以通過阻礙tgfβ誘導(dǎo)的emt發(fā)揮其抑癌作用。5.mir-203抑制nsg小鼠模型癌細(xì)胞腫瘤的生長。6.瘦素在卵巢癌病人血清、尿液及腫瘤在組織中表達(dá)升高。7.沉默snail2的表達(dá)可以達(dá)到mir-203在卵巢癌中的功能。結(jié)論1.miR-203在人卵巢癌細(xì)胞中通過抑制snail2基因的表達(dá)抑制EMT,從而發(fā)揮其抑癌作用。2.miR-203的表達(dá)抑制了卵巢癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長。3.結(jié)合臨床標(biāo)本,動物實驗及離體細(xì)胞研究,我們首次發(fā)現(xiàn)miR-203是一個擁有巨大潛力的卵巢癌生物標(biāo)記物,在卵巢癌的臨床篩查,早期診斷及療效判定等方面均具有重要意義。4.瘦素在卵巢癌病人血清、尿液和腫瘤組織中的表達(dá)升高,預(yù)示著瘦素有望可以作為卵巢癌的臨床診斷指標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：miR-203 瘦素 間葉細(xì)胞向上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 卵巢癌
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 摘要4-9
• Abstract9-16
• 中英文縮略詞16-17
• 1 引言17-20
• 2 實驗標(biāo)本及儀器20-32
• 3 結(jié)果32-43
• 4 討論43-47
• 5 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 綜述 miRNA和腫瘤54-65
• 參考文獻(xiàn)63-65
• 個人簡歷、在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果65-67
• 致謝67-68

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