本文關(guān)鍵詞：HPIP對腫瘤細(xì)胞自噬功能的影響及與LC3B的相互作用

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【摘要】：目的：自噬(autophagy)是真核生物細(xì)胞特有的一種生命現(xiàn)象,實(shí)質(zhì)是自噬溶酶體降解體內(nèi)的大分子物質(zhì)(如細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等),為細(xì)胞生存代謝提供營養(yǎng)物質(zhì)。自噬作為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡(type Ⅱ programed cell death),在生物進(jìn)化過程中具有高度保守性。目前研究發(fā)現(xiàn),自噬參與了多種疾病的發(fā)生,如病原體感染、神經(jīng)退行性疾病、衰老、腫瘤等。我們的研究方向主要是自噬對于腫瘤的影響,體外探討HPIP(hematopoietic pre-B-cell leukemia transcription factor-interacting protein,人造血相關(guān)的前B細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)錄因子相互作用蛋白)對腫瘤細(xì)胞自噬的影響。方法：利用PCR技術(shù)從人的乳腺文庫中擴(kuò)增出LC3B目的基因片段全長及各分段序列,同時(shí)擴(kuò)增出ATG4B目的基因片段,將這些序列插入到pGEX-KG及pET-28a(K+)載體中,構(gòu)建出重組質(zhì)粒；體外給予不同的自噬誘導(dǎo)條件,通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察HPIP與LC3B的共定位情況；細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測HPIP與LC3B的定位；GST pull-down技術(shù)檢測HPIP與LC3B的作用部位。結(jié)果：免疫共沉淀檢測到HPIP蛋白與LC3B蛋白存在相互作用；免疫熒光發(fā)現(xiàn)HPIP與LC3B存在共定位；成功構(gòu)建了不同載體的目的基因片段；蛋白水平檢測HPIP對自噬有一定的影響；HPIP與ATG4B可共同作用于LC3B,且HPIP與ATG4B也存在相互作用。結(jié)論：HPIP參與了腫瘤細(xì)胞自噬過程,HPIP、LC3B與ATG4B之間兩兩存在相互作用,HPIP可能在自噬的ATG8泛素化結(jié)合過程中發(fā)揮作用,阻礙LC3B前體蛋白Pro-LC3B被ATG4B切割轉(zhuǎn)化成LC3B-I。
【關(guān)鍵詞】：HPIP 腫瘤 自噬 LC3B
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3
【目錄】：

• 中文摘要6-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-12
• 材料與方法12-19
• 1. 材料12-13
• 1.1 菌株與細(xì)胞株12
• 1.2 質(zhì)粒12
• 1.3 分子生物學(xué)試劑盒12
• 1.4 實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑12
• 1.5 細(xì)胞培養(yǎng)試劑12
• 1.6 抗體及蛋白偶聯(lián)珠12-13
• 1.7 主要實(shí)驗(yàn)儀器13
• 2. 方法13-19
• 2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定表達(dá)13-14
• 2.2 質(zhì)粒提取14-15
• 2.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染15
• 2.4 細(xì)胞免疫熒光15-16
• 2.5 Western Blot實(shí)驗(yàn)分析16
• 2.6 細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)16-17
• 2.7 體外蛋白純化及提取17
• 2.8 免疫共沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)17-18
• 2.9 GST pull-down實(shí)驗(yàn)分析18-19
• 結(jié)果19-29
• 1. 免疫共沉淀(IP實(shí)驗(yàn))發(fā)現(xiàn)HPIP與LC3B存在相互作用19
• 2. 免疫熒光觀察HPIP與LC3B的定位變化19-20
• 3. 細(xì)胞核質(zhì)實(shí)驗(yàn)分離檢測HPIP與LC3B的定位20-22
• 3.1 腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性LC3B的分布20-21
• 3.2 過表達(dá)HPIP基因的穩(wěn)定克隆細(xì)胞系中LC3B的分布21-22
• 4. 自噬干預(yù)條件下,HPIP與LC3B的定位22-24
• 4.1 自噬條件的選擇22-23
• 4.2 自噬誘導(dǎo)下,HPIP與LC3B的定位23-24
• 5. 自噬干預(yù)下,HPIP對自噬的作用24-25
• 6. HPIP與P62之間的相互作用關(guān)系25-26
• 7. HPIP與ATG4B對LC3B有競爭性作用26-29
• 7.1 HPIP與LC3B、ATG4B與LC3B之間的相互作用26-27
• 7.2 HPIP與ATG4B之間的相互作用27-28
• 7.3 HPIP與ATG4B均可與LC3B(151-377bp)結(jié)合28-29
• 討論29-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-37
• 文獻(xiàn)綜述37-48
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 附錄 (縮略詞表)48-50
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文50-51
• 致謝51

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：553199