本文關(guān)鍵詞：SCIN促進胃癌細(xì)胞侵襲機制及胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立

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【摘要】：第一部分摘要 SCIN促進胃癌細(xì)胞侵襲機制研究研究背景與研究目的:胃癌在全世界范圍內(nèi),其發(fā)病率排在所有腫瘤的第四位,而死亡率則位居所有腫瘤相關(guān)死亡原因的第二位。盡管由于近年來手術(shù)技術(shù)的發(fā)展、放化療的應(yīng)用以及早期診斷的增多,胃癌的死亡率有所下降,但是進展期胃癌患者的生存率仍然很低。許多胃癌患者在經(jīng)過根治手術(shù)以及化療后,仍然會有復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移,而在胃癌發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移后,其治療更加困難,手術(shù)難度加大。而胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是目前對其治療的最大難關(guān),目前對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機制仍然不甚明了,故闡明胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機制對胃癌的治療意義重大。我們課題組前期研究已經(jīng)表明,SCIN在胃癌組織中存在表達(dá),且表達(dá)明顯高于癌旁組織,SCIN的表達(dá)與患者預(yù)后存在明顯相關(guān)性,SCIN高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)者,SCIN還具有促進胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和成瘤的能力,但是其中的具體分子機制和通路仍然未知。本研究旨在闡明SCIN促進胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的具體機制,并探討SCIN作為胃癌預(yù)后指標(biāo)及成為治療靶點的可能性。主要材料及方法:1.通過免疫熒光染色的方法來觀察在敲低SCIN后,胃癌細(xì)胞系MGC803和原代胃癌細(xì)胞XN0422的偽足形成能力的變化情況。2.通過q RT-PCR檢測敲低SCIN后胃癌細(xì)胞系MGC803和原代胃癌細(xì)胞XN0422中Cdc42分子RNA表達(dá)的改變。3.通過Western blotting檢測在敲低SCIN后,胃癌細(xì)胞系MGC803和胃癌原代細(xì)胞XN0422中Cdc42分子蛋白表達(dá)的改變。主要研究結(jié)果:1.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),在胃癌細(xì)胞系MGC803和原代胃癌細(xì)胞XN0422中敲低SCIN后,兩種細(xì)胞均能觀察到敲低組細(xì)胞的偽足數(shù)量較對照組明顯減少。2.通過q RT-PCR檢測胃癌細(xì)胞系MGC803和原代胃癌細(xì)胞XN0422中敲低SCIN后,兩種細(xì)胞的敲低組Cdc42的RNA表達(dá)減少,且較對照組減少約50%。3.通過Western blotting檢測胃癌細(xì)胞系MGC803和原代胃癌細(xì)胞XN0422中敲低SCIN后,兩種細(xì)胞的敲低組Cdc42的蛋白表達(dá)均較對照組減少,而蛋白表達(dá)減少量較RNA表達(dá)減少量更加明顯。主要結(jié)論:1.偽足形成能力的改變參與了SCIN促進胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程。2.敲低SCIN可以降低胃癌細(xì)胞中Cdc42的RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量,說明SCIN對偽足形成的調(diào)控作用是通過對Cdc42的調(diào)控而實現(xiàn)。第二部分摘要 胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立及特性鑒定研究背景與研究目的:胃腸道間質(zhì)瘤(Gastrointestinal stromal tumor,GIST)是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤,起源于胃腸道間質(zhì)的Cajar細(xì)胞,其發(fā)病率約為每年10~20/10萬。胃腸道間質(zhì)瘤主要發(fā)生于胃(50%~70%),其次為小腸(20%~30%),其他發(fā)病部位可包括食管,結(jié)直腸甚至消化道外的其他部位(小于10%)。目前原發(fā)性胃腸道間質(zhì)瘤的主要治療方法是手術(shù)切除并配合術(shù)后伊馬替尼進行靶向治療。c-kit基因(75% 85%)或者PDGFRA基因(platelet-derived growth factor receptor alpha;5% 7%)發(fā)生功能獲得性突變是大多數(shù)胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)病的始動因素,進而使酪氨酸激酶持續(xù)激活,并獲得不受機體調(diào)控的增殖能力。因此胃腸道間質(zhì)瘤是可以通過酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼類藥物進行治療的。然而伊馬替尼也無法治愈此病,耐藥后的復(fù)發(fā)是最主要因素,有多達(dá)50%的患者會發(fā)生耐藥進而腫瘤復(fù)發(fā),而發(fā)生耐藥及復(fù)發(fā)的時間往往在中位治療期2年內(nèi)。盡管目前對伊馬替尼耐藥的部分機制有所了解,但是對其深層的分子機制仍然知之甚少。而當(dāng)前對胃腸道間質(zhì)瘤的研究因為缺乏合適的及容易獲取的細(xì)胞系而受到限制。據(jù)我們所知,目前有公開報道的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系并不多,僅包括GIST-T1、GIST-H1以及GK1C和GK3C。我們的研究旨在建立一株胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系,并對其進行相對完整的特性鑒定以使其可以廣泛應(yīng)用于胃腸道間質(zhì)瘤的研究。主要材料及方法:1.通過組織塊法對腫瘤組織進行原代細(xì)胞培養(yǎng),在腫瘤細(xì)胞爬出后通過局部傳代的方式富集腫瘤細(xì)胞,而后通過凍存、復(fù)蘇和傳代以淘汰成纖維細(xì)胞并獲得穩(wěn)定的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系。2.通過免疫組織化學(xué)染色的方法檢測患者腫瘤組織以及移植瘤中的CD117,CD34,DOG-1,α-SMA,S-100的表達(dá)。3.通過免疫熒光染色的方法檢測細(xì)胞中CD117分子的表達(dá)情況。4.通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法,檢測細(xì)胞中CD117,CD34,DOG-1,α-SMA,及S-100的表達(dá)。5.通過繪制生長曲線并計算倍增周期的方法以獲得其增殖能力特性。通過透射電鏡觀察細(xì)胞微結(jié)構(gòu),通過核型鑒定分析染色體變異情況。6.通過裸鼠皮下移植瘤形成實驗驗證其成瘤能力。將裸鼠按照接種細(xì)胞數(shù)目分為4組:1×104組,1×105組,5×105組,1×106組。每組4只裸鼠,每只裸鼠接種一個位點。7.通過伊馬替尼藥物殺傷實驗明確其對伊馬替尼的敏感性,并計算出伊馬替尼對其作用的IC50(half maximal inhibitory concentration,半抑制濃度)。8.通過對c-kit基因的第8、9、11、13、17外顯子及PDGFRA基因的第12、14、18外顯子測序,以明確其是否發(fā)生突變以及發(fā)生突變的位點及意義。9.所有實驗至少重復(fù)3次,實驗結(jié)果表述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)分析使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件,兩組間的比較采用t檢驗,移植瘤重量的比較采用非參數(shù)檢驗,伊馬替尼IC50的計算采用曲線擬合分析。主要實驗結(jié)果:1.通過組織塊法,成功分離并培養(yǎng)出胃腸道間質(zhì)瘤的腫瘤細(xì)胞,而后通過傳代,凍存和復(fù)蘇逐步淘汰掉其中的成纖維細(xì)胞,并使其適應(yīng)體外生長環(huán)境,表現(xiàn)出穩(wěn)定的細(xì)胞形態(tài)及特性。2.對患者腫瘤組織以及裸鼠移植瘤的免疫組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn),CD117(+)、CD34(+)、DOG-1(+)、α-SMA(-)、S100(-)。3.免疫熒光檢測細(xì)胞中CD117的表達(dá),結(jié)果表明CD117在此細(xì)胞中存在表達(dá),表達(dá)主要位于細(xì)胞膜。4.通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測細(xì)胞中的分子表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD117(+)、CD34(+)、DOG-1(+)、α-SMA(-)、S100(-),同患者腫瘤組織及移植瘤檢測的結(jié)果相同。5.根據(jù)實驗結(jié)果繪制生長曲線,并計算得其倍增周期為24.063h。透射電鏡觀察細(xì)胞微結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示其細(xì)胞核明顯增大,核質(zhì)比增高,核膜清晰,核仁大,可有單個或雙個,核形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞微絨毛減少或消失。通過核型鑒定檢測其染色體變異情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其染色體為亞三倍體核型的組合核型,染色體數(shù)目約為64~68條。存在涉及到Y(jié)、1、2、3、4、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、19、21、22等多條染色體參與的復(fù)雜數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常,包括易位、缺失、重復(fù)等。6.此細(xì)胞系具有高效的成瘤能力。移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)1×106組最早于接種第7天出現(xiàn)肉眼可見腫瘤,而1×104組最早于第13天出現(xiàn)肉眼可見腫瘤,3周后所有接種位點均有肉眼可見腫瘤形成,此時收割腫瘤。重量統(tǒng)計結(jié)果顯示移植瘤重量與接種細(xì)胞數(shù)目正相關(guān),且各組形成移植瘤的重量具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。7.使用伊馬替尼檢測其藥物敏感性并計算出IC50值,結(jié)果表明此細(xì)胞對伊馬替尼許多敏感,IC50=0.5343μmol/L。8.使用外顯子測序技術(shù)檢測了c-kit基因的8、9、11、13、17號外顯子以及PDGFRA基因的12、14、18號外顯子。結(jié)果顯示c-kit基因的五個外顯子及PDGFRA基因的14號外顯子未發(fā)生突變,而PDGFRA基因的12號外顯子于1701位點發(fā)生突變,AG;18號外顯子的2472位點CT。二者均為同義突變,不影響氨基酸編碼。主要結(jié)論:1.成功從患者腫瘤組織中分離培養(yǎng)出一例胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系。2.此細(xì)胞系分子表型為CD117(+)、CD34(+)、DOG-1(+)、SMA(-)、S100(-),倍增周期為24.063h。3.此細(xì)胞具備成瘤能力并對伊馬替尼相對敏感,IC50=0.5343μmol/L。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 侵襲轉(zhuǎn)移 肌切蛋白 偽足 Cdc42 胃腸道間質(zhì)瘤 原代培養(yǎng) CD117 CD34 DOG-1 伊馬替尼 倍增周期
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 英文摘要6-12
• 中文摘要12-16
• 第一部分 SCIN促進胃癌細(xì)胞侵襲機制研究16-41
• 第一章 前言16-25
• 1.1 選題緣由16-17
• 1.2 研究背景17-24
• 1.3 研究意義24-25
• 第二章 SCIN通過促進胃癌細(xì)胞偽足形成而促進侵襲轉(zhuǎn)移25-32
• 2.1 實驗材料25-26
• 2.2 實驗方法26-28
• 2.3 實驗結(jié)果28-30
• 2.4 討論30-32
• 第三章 Cdc42在SCIN促進的胃癌細(xì)胞偽足形成中發(fā)揮重要作用32-40
• 3.1 實驗材料32-34
• 3.2 實驗方法34-36
• 3.3 實驗結(jié)果36-38
• 3.4 討論38-40
• 第一部分小結(jié)40-41
• 第二部分 胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立41-67
• 第一章 前言41-43
• 1.1 研究背景41-42
• 1.2 研究意義42-43
• 第二章 胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系的分離與培養(yǎng)43-49
• 2.1 實驗材料43-44
• 2.2 實驗方法44-45
• 2.3 實驗結(jié)果45-47
• 2.4 討論47-49
• 第三章 胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系特性的鑒定49-66
• 3.1 實驗材料49-50
• 3.2 實驗方法50-57
• 3.3 實驗結(jié)果57-64
• 3.4 討論64-66
• 第二部分小結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 文獻(xiàn)綜述 胃腸道間質(zhì)瘤的生物學(xué)特征及診斷和治療進展74-85
• 參考文獻(xiàn)81-85
• 攻讀學(xué)位期間研究成果85-86
• 致謝86

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10 伍小軍;方m錁，

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