發(fā)布時間：2017-07-14 08:02

  本文關鍵詞：EHMT2抑制劑（BIX-01294）誘導人膀胱癌細胞凋亡分子機制的研究

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【摘要】：研究目的膀胱癌屬于人體全身十大最常見腫瘤。2012年全球新增膀胱癌病例43萬,死亡病例16.5萬。2012年我國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌發(fā)病率為6.61/10萬,位列我國惡性腫瘤發(fā)病率第9位,居我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病第一位。臨床膀胱癌治療方法的選擇取決于腫瘤侵潤膀胱壁的程度。電切術、全膀胱切除術治療或膀胱部分切除術后,患者預后不佳,復發(fā)率極高。目前,基于順鉑的聯(lián)合化療方案(M-VAC方案)和順鉑方案(GC方案)已成為可以耐受順鉑的膀胱癌患者的標準治療方案,但卻無法回避化療藥物的毒副作用。而根據(jù)腫瘤標記物及其所在通路對膀胱癌患者進行靶向治療,不僅不會波及腫瘤周圍的正常組織細胞能有效殺傷癌細胞,可減少副作用,而且可提高患者耐受性，有很大臨床應用前景。而包括西妥昔單抗、貝伐珠單抗等在內的膀胱癌靶向藥物在臨床研究階段并未表現(xiàn)出明顯的治療效果。故針對膀胱癌的靶向藥物的開發(fā)和試驗成為目前亟待解決的問題。作為常染色質組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶2(Euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2, EHMT2)的抑制劑,BIX-01294已被報道可以抑制膀胱癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌細胞的生長。我們通過前期藥物篩選實驗發(fā)現(xiàn),BIX-01294能夠明顯抑制人類膀胱癌細胞的增殖。然而,BIX-01294誘導人類膀胱癌細胞凋亡的具體機制還尚無報道。本課題旨在闡明在BIX-01294誘導膀胱癌細胞凋亡的分子機制。研究方法1.磺酰羅丹明B (SRB)比色法檢測BIX-01294對人膀胱癌細胞存活率的影響。2.免疫印跡法(Western Blot)檢測BIX-01294處理后人膀胱癌細胞凋亡相關蛋白水平變化。3. 流式細胞術檢測BIX-01294誘導人膀胱癌細胞凋亡的改變。4. siRNA干擾技術和外源表達研究EHMT2、PMAIP1、MCL1、USP9X、 DDIT3、TNFRSFIOA等基因在BIX-01294誘導人膀胱癌細胞凋亡過程中的作用。研究結果1.BIX-01294抑制T24和5637這兩種人膀胱癌細胞的存活,并呈劑量依賴性。并且BIX-01294能激活凋亡蛋白酶CASP級聯(lián)反應,具有劑量和時間依賴效應；且在敲低EHMT2后增強了BIX-01294誘導的CASP級聯(lián)反應。2. BIX-01294上調T24和5637細胞中PMAIP1的表達,同時能夠下調MCL1的表達,具有劑量和時間依賴效應。在T24和5637細胞中敲低PMAIP1和過表達MCL1均能夠拯救BIX-01294引起的凋亡。3.BIX-01294下調T24和5637細胞中USP9X的表達,具有劑量和時間依賴效應。敲低USP9X可以下調MCL1同時增強BIX-01294誘導凋亡的作用。4.BIX-01294上調T24和5637細胞中DDIT3的表達,具有劑量和時間依賴效應。敲低DDIT3可以拯救BIX-01294誘導的凋亡。5. BIX-01294在T24和5637細胞中上調內質網(wǎng)應激反應相關蛋白HSPA5、ERN1和ATF4,并具有劑量和時間依賴效應。6.在T24和5637細胞中敲低CASP8能夠削弱BIX-01294誘導的細胞凋亡。BIX-01294上調T24和5637細胞中TNFRSF10A的表達,具有劑量和時間依賴效應。敲低TNFRSF10A可以削弱BIX-01294誘導的細胞凋亡。7.在T24和5637細胞中敲低DDIT3使BIX-01294引起的TNFRSF10A表達上調的程度減弱。結論1.BIX-01294能夠誘導人膀胱癌細胞凋亡,并與其抑制EHMT2的功能有關。2. BIX-01294誘導人膀胱癌細胞中的內質網(wǎng)應激反應。3. BIX-01294通過內質網(wǎng)應激反應,激活PMAIP1-USP9X-MCL1通路,引發(fā)膀胱癌細胞內源途徑凋亡。4. BIX-01294通過內質網(wǎng)應激反應,上調TNFRSFIOA,從而引起人膀胱癌細胞外源途徑凋亡。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)BIX-01294能誘導人膀胱癌細胞凋亡。BIX-01294誘導細胞凋亡的分子機制。BIX-01294作為EHMT2特異性抑制劑,通過激活內質網(wǎng)應激反應,上調DDIT3的表達,進而通過PMAIP1-USP9X-MCL1內源途徑和上調死亡受體TNFRSF10A激活外源途徑誘導細胞凋亡。
【關鍵詞】：BIX-01294 細胞凋亡 DDIT3 PMAIP1 TNFRSF10A
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.14
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 符號說明12-15
• 前言15-25
• 1 膀胱癌及膀胱癌的治療15-16
• 2 組蛋白甲基化、EHMT2及其抑制劑16-17
• 2.1 組蛋白甲基化16-17
• 2.2 EHMT2及其抑制劑BIX-0129417
• 3 內質網(wǎng)應激反應17-21
• 3.1 ATF418-19
• 3.2 DDIT319-21
• 4 細胞凋亡21-25
• 4.1 內源凋亡途徑21-22
• 4.2 外源凋亡途徑22-25
• 實驗材料與方法25-39
• 1 實驗材料25-31
• 1.1 細胞株25
• 1.2 實驗藥品與實驗試劑25-27
• 1.3 實驗儀器與實驗耗材27-29
• 1.4 實驗藥品與試劑配方29-31
• 2 實驗方法31-39
• 2.1 細胞培養(yǎng)31-33
• 2.2 SRB染色測定細胞存活率33
• 2.3 siRNA轉染33-34
• 2.4 質粒轉染34-35
• 2.5 Western Blot35-36
• 2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡36-37
• 2.7 統(tǒng)計學分析37-39
• 實驗結果39-55
• 1 BIX-01294激活人人膀胱癌細胞CASP級聯(lián)反應并誘導凋亡39-41
• 2 BIX-01294通過內源凋亡途徑誘導人膀胱癌細胞發(fā)生凋亡41-50
• 2.1 BIX-01294通過PMAIP1和MCL1誘導細胞凋亡發(fā)生41-44
• 2.2 BIX-01294通過USP9X影響MCL1的表達44-46
• 2.3 DDIT3介導了BIX-01294引起的PMAIP1表達量的上調46-49
• 2.4 BIX-01294能夠激活內質網(wǎng)應激反應(ER Stress)49-50
• 3 BIX-01294通過外源凋亡途徑誘導人膀胱癌細胞發(fā)生凋亡50-55
• 3.1 BIX-01294通過激活死亡受體TNFRSF10A引發(fā)外源凋亡途徑50-53
• 3.2 BIX-01294通過DDIT3上調死亡受體TNFRSF10A53-55
• 討論55-59
• 參考文獻59-69
• 致謝69-71
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文71

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本文編號：540236