本文關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌中靶向調(diào)控MTA1基因microRNA的鑒定及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制

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【摘要】：研究背景：肺癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤,有將近80-85%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。大約有56%的肺癌患者在確診時(shí)為肺癌晚期,而僅有15%的患者在早期被發(fā)現(xiàn),故肺癌的5年總生存率也僅有17.1%。眾所周知,腫瘤轉(zhuǎn)移是制約非小細(xì)胞肺癌患者治療效果和總生存率的重要因素。因此,關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制方面的研究對(duì)于疾病的發(fā)生和開發(fā)新的靶向藥物治療都是非常有必要的。最初,轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(MTA1)是在鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌中經(jīng)cDNA庫(kù)差異篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)的,是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。它在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌及乳腺癌等許多腫瘤中都是高表達(dá)的。在過去的幾十年里,作為核小體重塑和去乙酰化(nucleosome remodeling and deacetylating,NuRD)復(fù)合物不可缺的亞基之一,MTAl可以在轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控DNA損傷應(yīng)答、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及炎癥的形成。然而,為了使MTAl的分子靶向治療成為可能,我們就必須對(duì)MTA1的異常表達(dá)機(jī)制做進(jìn)一步研究。微小RNA(miRNAs)是一種小的非編碼RNA,它是由18-23個(gè)核苷酸組成。miRNA可以通過與信使RNA(mRNA)的3’或5’非編碼區(qū)(UTR)結(jié)合,導(dǎo)致mRNA降解、翻譯抑制或活化、形成異染色質(zhì),從而調(diào)控基因的表達(dá)。大量研究表明,通過調(diào)控不同的基因,miRNA可以在腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌的作用。例如,miR-200家族可以抑制腫瘤的EMT通過調(diào)節(jié)PTEN信號(hào)通路,miR-21可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道,MTA1可以與miRNA相互作用,但僅為冰山一角,miRNAs與MTA1之間的調(diào)控關(guān)系仍需進(jìn)一步的研究。這里,我們運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件分析靶向調(diào)控MTAl的miRNAs。我們基于兩個(gè)常用的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站(Targetscan和microrna.org),預(yù)測(cè)出miR-199a/b-5p, miR-125a-3p共3個(gè)候選miRNAs可能與MTAl的3’非編碼區(qū)結(jié)合。并且,通過查閱文獻(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)這3個(gè)候選miRNAs都可作為抑癌基因抑制腫瘤遷移和侵襲。在本研究中,我們擬通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,篩選出與非小細(xì)胞肺癌中靶向MTA1 3'UTR的候選miRNA,再用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證候選miRNA通過直接與MTA1 3'UTR結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)其表達(dá)。并通過一系列體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MTAl介導(dǎo)了候選miRNA對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力的影響。最后,在非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中證實(shí)候選miRNA與MTAl表達(dá)之間的相關(guān)性。材料和方法組織標(biāo)本本研究所用8對(duì)肺癌組織手術(shù)樣本(癌和癌旁)來自8位病人,他們均在南方醫(yī)院接受手術(shù),而且這8位病人在手術(shù)前均未接受過化療或放療。這些組織的病理診斷均由南方醫(yī)院病理科提供,包括3例肺鱗癌(高分化1例、中分化2例),其余5例為肺腺癌(高分化1例,中分化2例、低分化2例)。這些標(biāo)本收集后立即放入液氮中保存。細(xì)胞培養(yǎng)HEK-293T,SPC-A-1和95D細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),并采用含10%胎牛血清的DMEM (Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng),并放置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。載體構(gòu)建候選miRNA的mimics,抑制MTA1的小干擾RNA(si-MTA1)以及它們的陰性對(duì)照都是由上海吉瑪公司合成,它們的序列分別是：miR-199a-5p mimics: 5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3',miR-199b-5p mimics:5'-CCCAGUG UUUAGACUAUCUGUUC-3', miR-125a-3p mimics:5'-ACAGGUGAGGUU CUUGGGAGCC-3'; mimics/NC:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3', si-MTA1:5'-CCAGCAUCAUUGAGUACUATT-3';非特異干擾對(duì)照：5'-GCGACGAUCUGCCUAAGAUdTdT-3'瞬時(shí)轉(zhuǎn)染接種適量的細(xì)胞于六孔板中,18-24h后按照Lipofectamine 3000(Invitrogen)說明書轉(zhuǎn)染miRNA mimics或siRNAs(100μM),轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h。蛋白質(zhì)免疫印跡細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲,用收集的細(xì)胞提取總蛋白,并用10%的SDS-PAGE膠跑蛋白質(zhì)電泳,將不同分子量的蛋白質(zhì)區(qū)分開,然后再轉(zhuǎn)到PVDF膜(Millpore)上。所用的一抗抗體均為單克隆抗體：MTAl配比是1：1500(Abcam, Cambridge, USA);β-actin配比是1:5000(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)。RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)利用美國(guó)英濰捷基公司的Trizol裂解液提取細(xì)胞和組織的總RNA。利用TaqMan Reverse Transcription Kit (Takara, Dalian, China)進(jìn)行mRNA的逆轉(zhuǎn)錄、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Takara, Dalian, China)進(jìn)行miRNA的逆轉(zhuǎn)錄。分別使用miRscript SYBR Green PCR kit和SYBR Green PCR Kit (Takara, Dalian, China),并在Roche LightCycler 480 (Roche, Switzerland)儀器上進(jìn)行miRNA和mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量。我們選用U6作為miRNA的內(nèi)參,GAPDH作為mRNA的內(nèi)參。采用公式RQ=2-△△ct計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)由上海吉瑪公司將miR-125a-3p與MTA1 3'UTR結(jié)合位點(diǎn)突變序列和未突變序列構(gòu)建到pmirGLO載體內(nèi),再將HEK293T和SPC-A-1細(xì)胞接種于24孔板,培養(yǎng)1天后用于共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將50 ng野生型或突變型的熒光素酶質(zhì)粒和20 pMmiR-125a-3p mimics或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后,運(yùn)用Promega公司的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的熒光活性。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞接種到96孔板中,每孔3×103個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)1至5天。在接下來的第1、3、5天,分別在每個(gè)孔中加入20μl的MTT(5 mg/ml;Sigma, St. Louis, Missouri, USA),放孵箱孵育4h。然后棄上清,加入150μl DMSO溶液,震蕩搖勻后用酶標(biāo)儀(ELx800; BioTek, Winooski, USA)檢測(cè)490nm波長(zhǎng)時(shí)每孔的吸光值(OD值)。EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)使用的是廣州瑞博公司的EDU檢測(cè)試劑盒,具體實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書。我們將轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞接種到6孔板中,500個(gè)/孔,并用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)10-14天,然后再用4%的甲醇固定細(xì)胞,并用0.1%的結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的克隆團(tuán)個(gè)數(shù)。遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)劃痕實(shí)驗(yàn)6孔板每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24h后共轉(zhuǎn)染miRNA mimics或miR-NC和si-MTAl或si-NC,轉(zhuǎn)染后24h用200μl的槍頭垂直劃向孔底,并將完全培養(yǎng)基換成無血清培基,在0h和48h時(shí)拿去顯微鏡下拍照。Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)將共轉(zhuǎn)染miRNA mimics或 miR-NC和si-MTAl或si-NC的細(xì)胞培養(yǎng)24h后,用無血清培養(yǎng)基重懸鋪到Transwell上室(侵襲實(shí)驗(yàn)還需要在接種細(xì)胞之前在小室上鋪一層基質(zhì)膠),以每孔5萬個(gè)細(xì)胞量接種于Transwell上室,在下室中加入500gL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37℃,5%C02,培養(yǎng)24h。24h后,用4%多聚甲醛固定transwell、室5 min,用0.1%的結(jié)晶紫染色5 min。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)(two-tailed unpaired Student's t-test), miR-125a-3p和MTA1的相關(guān)性分析采用Spearman's相關(guān),P值0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、調(diào)控MTA1的上游靶基因的篩選和鑒定在NSCLC中MTA1扮演著促癌基因的角色,并發(fā)揮著舉足輕重的作用。為了探究aiR-199a-5p, miR-199b-5p和miR-125a-3p3個(gè)候選抑癌miRNA中究竟哪個(gè)miRNA可以下調(diào)MTA1的表達(dá),我們采用qRT-PCR和Western blotting在SPC-A-1和95D細(xì)胞中作進(jìn)一步驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)3個(gè)候選miRNA并不影響MTA1的mRNA水平,而miR-125a-3p可以下調(diào)MTA1的蛋白表達(dá),miR-199a-5p和miR-199b-5p則對(duì)M TA1的蛋白水平表達(dá)沒有明顯的影響。證實(shí)了miR-125a-3p可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控MTA1表達(dá),抑制其蛋白翻譯。我們運(yùn)用Targetscan和microrna.org兩個(gè)常用的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站來預(yù)測(cè)miR-125a-3p在MTA1的3'UTR區(qū)較為穩(wěn)定及保守的結(jié)合位點(diǎn)。為了進(jìn)一步證明miR-125a-3p和MTA1的直接靶向調(diào)控關(guān)系,我們又將含有MTA1 3'UTR野生型及突變型的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒分別與niR-125a-3p mimics及陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染到HEK293T和SPC-A-1細(xì)胞中,并檢測(cè)熒光素酶的活性。結(jié)果顯示在HEK293T和SPC-A-1細(xì)胞中miR-125a-3p均可抑制MTA1 3'UTR野生型熒光素酶報(bào)告基因載體的活性,對(duì)突變型無影響,進(jìn)一步證實(shí)了miR-125a-3p可以直接靶向MTA1的3’UTR在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控MTA1。2、miR-125a-3p靶向MTAl對(duì)NSCLC生物學(xué)功能的影響首先,我們檢測(cè)了共轉(zhuǎn)染miR-125a-3p和si-MTA1的SPC-A-1和95D細(xì)胞株中miR-125a-3p的表達(dá)以及對(duì)MTA1 mRNA和蛋白水平的干擾效率,證明了轉(zhuǎn)染的有效性。也再次證實(shí)了miR-125a-3p可以下調(diào)MTA1的蛋白水平,并不影響MTA1的mRNA表達(dá)。MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用siRNA干擾MTA1的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖活性和克隆形成率,與miR-125a-3p在肺癌細(xì)胞中所發(fā)揮的抑制細(xì)胞增殖的作用相仿,并能進(jìn)一步增強(qiáng)miR-125a-3p對(duì)細(xì)胞增殖的抑制功能。在EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)中也得到了同樣的結(jié)果。提示miR-125a-3p靶向MTA1抑制了NSCLC細(xì)胞的增殖能力。為了檢測(cè)miR-125a-3p是否通過靶向MTA1影響NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移能力,我們進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)(鋪膠或不鋪膠),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-125a-3p和干擾MTA1均能抑制細(xì)胞的侵襲和遷移,而且共轉(zhuǎn)染miR-125a-3pmimics和si-MTA1的SPC-A-1和95D細(xì)胞侵襲和遷移的能力與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-125a-3p mimics或si-MTA1的細(xì)胞相似。MTA1介導(dǎo)了miR-125a-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力的影響。3、miR-125a-3p與MTAl在NSCLC組織中的表達(dá)相關(guān)性在體外實(shí)驗(yàn)中,我們已經(jīng)驗(yàn)證了miR-125a-3p可以直接靶向調(diào)控MTA1蛋白表達(dá),于是我們猜想在NSCLC組織中miR-125a-3p和MTA1之間是否存在同樣的相關(guān)性。我們用了8對(duì)NSCLC臨床標(biāo)本檢測(cè)miR-125a-3p和MTA1蛋白的表達(dá),并用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)檢測(cè)miR-125a-3p和MTA1蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)在N SCL C組織中miR-125a-3p和MTA1之間存在負(fù)相關(guān)(r=-0.762,P=0.028)。結(jié)論1、niR-125a-3p直接作用于MTA1的3'UTR在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)MTAl的蛋白表達(dá)；2、miR-125a-3p通過靶向調(diào)控MTA1抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力；3、miR-125a-3p與MTA1蛋白表達(dá)在NSCLC組織中呈負(fù)相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：MiR-125a-3p MTA1 非小細(xì)胞肺癌 增殖 侵襲 遷移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-24
• 技術(shù)路線24-25
• 第一章 調(diào)控MTA1的上游靶基因的篩選與鑒定25-45
• 前言25
• 1.1 材料和儀器25-26
• 1.2 方法26-39
• 1.3 結(jié)果39-42
• 1.4 討論42-45
• 第二章 miR-125a-3p靶向MTA1對(duì)NSCLC生物學(xué)功能的影響45-61
• 前言45
• 2.1 材料與設(shè)備45-47
• 2.2 方法47-52
• 2.3 結(jié)果52-58
• 2.4 討論58-61
• 第三章 miR-125a-3p與MTA1在NSCLC組織中的表達(dá)相關(guān)性61-66
• 前言61
• 3.1 材料與設(shè)備61-62
• 3.2 方法62-63
• 3.3 結(jié)果63-64
• 3.4 討論64-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 全文小結(jié)72-73
• 研究生期間成果73-74
• 致謝74-75

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 潘請(qǐng);丁丁;馬筱玲;;miR-125家族與腫瘤的相關(guān)性研究進(jìn)展[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2015年04期

2 范忠義;焦順昌;;Mir-125a與相關(guān)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2015年11期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 林毅;血管生成素樣蛋白3及不同結(jié)構(gòu)域影響足細(xì)胞骨架重排的機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 游志峰;肺腺鱗癌組織中miRNA表達(dá)譜的變化與放療敏感性的關(guān)系[D];中南大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：529538