本文關鍵詞：非小細胞肺癌中靶向調控MTA1基因microRNA的鑒定及其表達調控機制

  更多相關文章： MiR-125a-3p MTA1 非小細胞肺癌 增殖 侵襲 遷移

【摘要】：研究背景：肺癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤,有將近80-85%的肺癌患者為非小細胞肺癌(NSCLC)。大約有56%的肺癌患者在確診時為肺癌晚期,而僅有15%的患者在早期被發(fā)現(xiàn),故肺癌的5年總生存率也僅有17.1%。眾所周知,腫瘤轉移是制約非小細胞肺癌患者治療效果和總生存率的重要因素。因此,關于腫瘤轉移的分子機制方面的研究對于疾病的發(fā)生和開發(fā)新的靶向藥物治療都是非常有必要的。最初,轉移相關基因(MTA1)是在鼠轉移性乳腺癌中經cDNA庫差異篩選技術發(fā)現(xiàn)的,是一種與腫瘤轉移相關的基因。它在非小細胞肺癌、結直腸癌、肝細胞癌及乳腺癌等許多腫瘤中都是高表達的。在過去的幾十年里,作為核小體重塑和去乙�；�(nucleosome remodeling and deacetylating,NuRD)復合物不可缺的亞基之一,MTAl可以在轉錄和非轉錄水平調控DNA損傷應答、上皮間質轉化(EMT)及炎癥的形成。然而,為了使MTAl的分子靶向治療成為可能,我們就必須對MTA1的異常表達機制做進一步研究。微小RNA(miRNAs)是一種小的非編碼RNA,它是由18-23個核苷酸組成。miRNA可以通過與信使RNA(mRNA)的3’或5’非編碼區(qū)(UTR)結合,導致mRNA降解、翻譯抑制或活化、形成異染色質,從而調控基因的表達。大量研究表明,通過調控不同的基因,miRNA可以在腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌的作用。例如,miR-200家族可以抑制腫瘤的EMT通過調節(jié)PTEN信號通路,miR-21可以促進非小細胞肺癌細胞的侵襲和遷移能力。目前已有文獻報道,MTA1可以與miRNA相互作用,但僅為冰山一角,miRNAs與MTA1之間的調控關系仍需進一步的研究。這里,我們運用生物信息學分析軟件分析靶向調控MTAl的miRNAs。我們基于兩個常用的生物信息學預測網(wǎng)站(Targetscan和microrna.org),預測出miR-199a/b-5p, miR-125a-3p共3個候選miRNAs可能與MTAl的3’非編碼區(qū)結合。并且,通過查閱文獻,我們發(fā)現(xiàn)這3個候選miRNAs都可作為抑癌基因抑制腫瘤遷移和侵襲。在本研究中,我們擬通過生物信息學網(wǎng)站預測并結合文獻報道,篩選出與非小細胞肺癌中靶向MTA1 3'UTR的候選miRNA,再用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證候選miRNA通過直接與MTA1 3'UTR結合在轉錄后水平調節(jié)其表達。并通過一系列體外實驗證實MTAl介導了候選miRNA對非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲遷移能力的影響。最后,在非小細胞肺癌組織標本中證實候選miRNA與MTAl表達之間的相關性。材料和方法組織標本本研究所用8對肺癌組織手術樣本(癌和癌旁)來自8位病人,他們均在南方醫(yī)院接受手術,而且這8位病人在手術前均未接受過化療或放療。這些組織的病理診斷均由南方醫(yī)院病理科提供,包括3例肺鱗癌(高分化1例、中分化2例),其余5例為肺腺癌(高分化1例,中分化2例、低分化2例)。這些標本收集后立即放入液氮中保存。細胞培養(yǎng)HEK-293T,SPC-A-1和95D細胞系均購自中國科學院上海細胞庫,并采用含10%胎牛血清的DMEM (Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng),并放置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。載體構建候選miRNA的mimics,抑制MTA1的小干擾RNA(si-MTA1)以及它們的陰性對照都是由上海吉瑪公司合成,它們的序列分別是：miR-199a-5p mimics: 5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3',miR-199b-5p mimics:5'-CCCAGUG UUUAGACUAUCUGUUC-3', miR-125a-3p mimics:5'-ACAGGUGAGGUU CUUGGGAGCC-3'; mimics/NC:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3', si-MTA1:5'-CCAGCAUCAUUGAGUACUATT-3';非特異干擾對照：5'-GCGACGAUCUGCCUAAGAUdTdT-3'瞬時轉染接種適量的細胞于六孔板中,18-24h后按照Lipofectamine 3000(Invitrogen)說明書轉染miRNA mimics或siRNAs(100μM),轉染后培養(yǎng)48h。蛋白質免疫印跡細胞在轉染后48小時收獲,用收集的細胞提取總蛋白,并用10%的SDS-PAGE膠跑蛋白質電泳,將不同分子量的蛋白質區(qū)分開,然后再轉到PVDF膜(Millpore)上。所用的一抗抗體均為單克隆抗體：MTAl配比是1：1500(Abcam, Cambridge, USA);β-actin配比是1:5000(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)。RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)利用美國英濰捷基公司的Trizol裂解液提取細胞和組織的總RNA。利用TaqMan Reverse Transcription Kit (Takara, Dalian, China)進行mRNA的逆轉錄、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Takara, Dalian, China)進行miRNA的逆轉錄。分別使用miRscript SYBR Green PCR kit和SYBR Green PCR Kit (Takara, Dalian, China),并在Roche LightCycler 480 (Roche, Switzerland)儀器上進行miRNA和mRNA的實時熒光定量。我們選用U6作為miRNA的內參,GAPDH作為mRNA的內參。采用公式RQ=2-△△ct計算目的基因相對于內參基因的表達量。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)由上海吉瑪公司將miR-125a-3p與MTA1 3'UTR結合位點突變序列和未突變序列構建到pmirGLO載體內,再將HEK293T和SPC-A-1細胞接種于24孔板,培養(yǎng)1天后用于共轉染實驗。將50 ng野生型或突變型的熒光素酶質粒和20 pMmiR-125a-3p mimics或陰性對照共轉染細胞。轉染48h后,運用Promega公司的雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測試劑盒檢測細胞的熒光活性。細胞增殖實驗將轉染24h后的細胞接種到96孔板中,每孔3×103個細胞,培養(yǎng)1至5天。在接下來的第1、3、5天,分別在每個孔中加入20μl的MTT(5 mg/ml;Sigma, St. Louis, Missouri, USA),放孵箱孵育4h。然后棄上清,加入150μl DMSO溶液,震蕩搖勻后用酶標儀(ELx800; BioTek, Winooski, USA)檢測490nm波長時每孔的吸光值(OD值)。EDU細胞增殖檢測實驗使用的是廣州瑞博公司的EDU檢測試劑盒,具體實驗步驟參照說明書。我們將轉染后48h的細胞接種到6孔板中,500個/孔,并用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)10-14天,然后再用4%的甲醇固定細胞,并用0.1%的結晶紫染色,顯微鏡下計數(shù)≥50個細胞的克隆團個數(shù)。遷移和侵襲實驗劃痕實驗6孔板每孔接種5×105個細胞,培養(yǎng)24h后共轉染miRNA mimics或miR-NC和si-MTAl或si-NC,轉染后24h用200μl的槍頭垂直劃向孔底,并將完全培養(yǎng)基換成無血清培基,在0h和48h時拿去顯微鏡下拍照。Transwell遷移及侵襲實驗將共轉染miRNA mimics或 miR-NC和si-MTAl或si-NC的細胞培養(yǎng)24h后,用無血清培養(yǎng)基重懸鋪到Transwell上室(侵襲實驗還需要在接種細胞之前在小室上鋪一層基質膠),以每孔5萬個細胞量接種于Transwell上室,在下室中加入500gL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37℃,5%C02,培養(yǎng)24h。24h后,用4%多聚甲醛固定transwell、室5 min,用0.1%的結晶紫染色5 min。統(tǒng)計學分析采用SPSS14.0軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差表示,兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨立樣本的t檢驗(two-tailed unpaired Student's t-test), miR-125a-3p和MTA1的相關性分析采用Spearman's相關,P值0.05表示有統(tǒng)計學意義。結果1、調控MTA1的上游靶基因的篩選和鑒定在NSCLC中MTA1扮演著促癌基因的角色,并發(fā)揮著舉足輕重的作用。為了探究aiR-199a-5p, miR-199b-5p和miR-125a-3p3個候選抑癌miRNA中究竟哪個miRNA可以下調MTA1的表達,我們采用qRT-PCR和Western blotting在SPC-A-1和95D細胞中作進一步驗證,發(fā)現(xiàn)3個候選miRNA并不影響MTA1的mRNA水平,而miR-125a-3p可以下調MTA1的蛋白表達,miR-199a-5p和miR-199b-5p則對M TA1的蛋白水平表達沒有明顯的影響。證實了miR-125a-3p可以在轉錄后水平調控MTA1表達,抑制其蛋白翻譯。我們運用Targetscan和microrna.org兩個常用的生物信息學預測網(wǎng)站來預測miR-125a-3p在MTA1的3'UTR區(qū)較為穩(wěn)定及保守的結合位點。為了進一步證明miR-125a-3p和MTA1的直接靶向調控關系,我們又將含有MTA1 3'UTR野生型及突變型的熒光素酶報告基因質粒分別與niR-125a-3p mimics及陰性對照共轉染到HEK293T和SPC-A-1細胞中,并檢測熒光素酶的活性。結果顯示在HEK293T和SPC-A-1細胞中miR-125a-3p均可抑制MTA1 3'UTR野生型熒光素酶報告基因載體的活性,對突變型無影響,進一步證實了miR-125a-3p可以直接靶向MTA1的3’UTR在轉錄后水平調控MTA1。2、miR-125a-3p靶向MTAl對NSCLC生物學功能的影響首先,我們檢測了共轉染miR-125a-3p和si-MTA1的SPC-A-1和95D細胞株中miR-125a-3p的表達以及對MTA1 mRNA和蛋白水平的干擾效率,證明了轉染的有效性。也再次證實了miR-125a-3p可以下調MTA1的蛋白水平,并不影響MTA1的mRNA表達。MTT和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)用siRNA干擾MTA1的表達可以抑制肺癌細胞的增殖活性和克隆形成率,與miR-125a-3p在肺癌細胞中所發(fā)揮的抑制細胞增殖的作用相仿,并能進一步增強miR-125a-3p對細胞增殖的抑制功能。在EDU細胞增殖檢測中也得到了同樣的結果。提示miR-125a-3p靶向MTA1抑制了NSCLC細胞的增殖能力。為了檢測miR-125a-3p是否通過靶向MTA1影響NSCLC細胞的侵襲和遷移能力,我們進行了劃痕實驗和transwell實驗(鋪膠或不鋪膠),發(fā)現(xiàn)過表達miR-125a-3p和干擾MTA1均能抑制細胞的侵襲和遷移,而且共轉染miR-125a-3pmimics和si-MTA1的SPC-A-1和95D細胞侵襲和遷移的能力與單獨轉染miR-125a-3p mimics或si-MTA1的細胞相似。MTA1介導了miR-125a-3p對非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲遷移能力的影響。3、miR-125a-3p與MTAl在NSCLC組織中的表達相關性在體外實驗中,我們已經驗證了miR-125a-3p可以直接靶向調控MTA1蛋白表達,于是我們猜想在NSCLC組織中miR-125a-3p和MTA1之間是否存在同樣的相關性。我們用了8對NSCLC臨床標本檢測miR-125a-3p和MTA1蛋白的表達,并用Spearman相關性檢驗檢測miR-125a-3p和MTA1蛋白表達之間的相關性,發(fā)現(xiàn)在N SCL C組織中miR-125a-3p和MTA1之間存在負相關(r=-0.762,P=0.028)。結論1、niR-125a-3p直接作用于MTA1的3'UTR在轉錄后水平下調MTAl的蛋白表達；2、miR-125a-3p通過靶向調控MTA1抑制NSCLC細胞的增殖、侵襲和遷移能力；3、miR-125a-3p與MTA1蛋白表達在NSCLC組織中呈負相關。
【關鍵詞】：MiR-125a-3p MTA1 非小細胞肺癌 增殖 侵襲 遷移
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-24
• 技術路線24-25
• 第一章 調控MTA1的上游靶基因的篩選與鑒定25-45
• 前言25
• 1.1 材料和儀器25-26
• 1.2 方法26-39
• 1.3 結果39-42
• 1.4 討論42-45
• 第二章 miR-125a-3p靶向MTA1對NSCLC生物學功能的影響45-61
• 前言45
• 2.1 材料與設備45-47
• 2.2 方法47-52
• 2.3 結果52-58
• 2.4 討論58-61
• 第三章 miR-125a-3p與MTA1在NSCLC組織中的表達相關性61-66
• 前言61
• 3.1 材料與設備61-62
• 3.2 方法62-63
• 3.3 結果63-64
• 3.4 討論64-66
• 參考文獻66-72
• 全文小結72-73
• 研究生期間成果73-74
• 致謝74-75

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 潘請;丁丁;馬筱玲;;miR-125家族與腫瘤的相關性研究進展[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2015年04期

2 范忠義;焦順昌;;Mir-125a與相關疾病關系的研究進展[J];解放軍醫(yī)學院學報;2015年11期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 林毅;血管生成素樣蛋白3及不同結構域影響足細胞骨架重排的機制研究[D];復旦大學;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 游志峰;肺腺鱗癌組織中miRNA表達譜的變化與放療敏感性的關系[D];中南大學;2014年

，

本文編號：529538