發(fā)布時間：2017-07-06 16:23

  本文關(guān)鍵詞：急性髓系白血病中AML1-ETO融合基因?qū)IRT1基因和EZH1基因表達(dá)調(diào)控的機理研究

  更多相關(guān)文章： AML1-ETO SIRT1 EZH1 表觀遺傳學(xué) 基因表達(dá)調(diào)控 熒光素酶報告基因 AML

【摘要】：目的：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia-AML)是一類克隆性侵襲性血液病,由髓系細(xì)胞分化凋亡障礙、增殖失控引起。t(8；21)(q22；q22)是AML中最常見的染色體異位,異位后形成新的融合基因AML1-ETO。AML1-ETO融合基因作用于其他基因,導(dǎo)致基因異常激活,引起表觀遺傳學(xué)改變,影響造血分化、增殖以及凋亡等方面功能,被認(rèn)為是白血病的發(fā)病機制之一。表觀遺傳學(xué)改變包括了組蛋白的去乙酰化和組蛋白的甲基化,表觀遺傳學(xué)失調(diào)與血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。SIRT1基因產(chǎn)物具有去乙酰化酶活性,可導(dǎo)致組蛋白和非組蛋白的去乙�；�,引起眾多生理活動的改變;EZH1是一種重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,可介導(dǎo)組蛋白甲基化;因此本研究旨在深入分析SIRT1基因和EZH1基因的表達(dá)調(diào)控機制,尋找惡性血液病中決定兩者基因表達(dá)的核心啟動子區(qū),探索表觀遺傳學(xué)改變對AML1-ETO陽性白血病發(fā)生發(fā)展的影響,提供了選擇性靶向治療的實驗基礎(chǔ)。方法：本研究第一部分利用RT-PCR方法在AML1-ETO陽性白血病細(xì)胞株和白血病臨床樣本中初步研究AML1-ETO對SIRT1轉(zhuǎn)錄的影響。采用PCR法從含有SIRT1基因轉(zhuǎn)錄起始點5’區(qū)的基因片段中擴(kuò)增SIRT1基因核心啟動子序列,構(gòu)建SIRT1基因序列的熒光素酶報告重組質(zhì)粒,應(yīng)用SuperFect包裹熒光素酶報告重組子轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,采用雙熒光素酶檢測試劑盒測定重組質(zhì)粒相對熒光素酶活性以定位SIRT1基因核心啟動子位置。用SIRT1重組子分別轉(zhuǎn)染AML1-ETO陽性和陰性細(xì)胞系,用SIRT1重組子與不同劑量的AML1-ETO質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,采用雙熒光素酶報告檢測方法,進(jìn)一步研究AML1-ETO對SIRT1核心啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)作用。第二部分通過定量RT-PCR和Western Blot的方法觀察EZH1基因在AML1-ETO陽性和陰性細(xì)胞系中mRNA和蛋白表達(dá)水平變化。采用PCR方法從EZH1轉(zhuǎn)錄起始點的基因片段中擴(kuò)增EZH1基因核心啟動子序列,構(gòu)建EZH1基因序列的熒光素酶報告重組子,應(yīng)用SuperFect包裹熒光素酶報告重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AML1-ETO陽性和陰性細(xì)胞系,采用雙熒光素酶檢測試劑盒測定重組質(zhì)粒相對熒光素酶活性以定位EZH1基因核心啟動子區(qū)。通過生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)EZH1基因啟動子區(qū)含有多個AML1結(jié)合位點,用相同的方法構(gòu)建突變體熒光素酶報告重組子,與相應(yīng)的野生型重組子共同轉(zhuǎn)染AML1-ETO陽性和陰性細(xì)胞系,以探索AML1-ETO融合蛋白在EZH1啟動子區(qū)的結(jié)合情況。應(yīng)用ChIP技術(shù)進(jìn)一步探索AML1-ETO在EZH1啟動子區(qū)的結(jié)合情況。應(yīng)用特異的siRNA沉默EZH1的表達(dá)后使用CCK-8、PI染色法檢測EZH1對AML1-ETO陽性細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。結(jié)果：第一部分：RT-PCR方法檢測白血病樣本表明,與正常供者相比,AML1-ETO陽性的AML患者樣本中SIRT1表達(dá)水平明顯增高,4株細(xì)胞系,U937AE,U937,SKNO-1,SKNO-1-siAE(U937AE和SKNO-1為含有AML1-ETO融合基因的細(xì)胞株)中AML1-ETO陽性的細(xì)胞系,SIRT1表達(dá)水平明顯增高。應(yīng)用PCR法擴(kuò)增了6段SIRT1基因序列,構(gòu)建了6種SIRT1重組質(zhì)粒,采用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測6種SIRT1重組質(zhì)粒的熒光素酶活性,推斷出了核心啟動子位置位于啟動位點上游1769bp-2060bpo用SIRT1重組子分別轉(zhuǎn)染AML1-ETO陽性和陰性細(xì)胞系后檢測其相對熒光素酶活性,結(jié)果表明細(xì)胞中敲除AML1-ETO后,核心啟動子活性明顯下調(diào),應(yīng)用SIRT1重組子與不同劑量的AML1-ETO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后雙熒光素酶檢測結(jié)果示AML1-ETO融合基因數(shù)量的增加與核心啟動子活性呈正相關(guān)關(guān)系。第二部分：定量RT-PCR和Western Blot表明AML1-ETO陽性細(xì)胞系(U937AE和SKNO-1)的EZH1mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào),成功構(gòu)建了8種EZH1重組子和4種突變體重組子,雙熒光素酶活性檢測8種重組子定位了EZH1的核心啟動子位于下游1126-1164bp;用重組質(zhì)粒和突變體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AML1-ETO陽性和陰性細(xì)胞系后檢測其相對熒光素酶活性,確定了AML1-ETO與EZH1核心啟動子的結(jié)合位點位于+1109bp, ChIP實驗進(jìn)一步證實AML1-ETO通過結(jié)合該位點激活EZH1核心啟動子基因轉(zhuǎn)錄。EZH1表達(dá)沉默可以引起AML1-ETO陽性白血病細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期受抑。結(jié)論：第一部分：SIRT1可能是AML1-ETO的靶基因之一。AML1-ETO與SIRT1基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系,提示AML1-ETO通過促進(jìn)SIRT1核心啟動子活性對其進(jìn)行正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控。為深入研究SIRT1基因在白血病中的高表達(dá)以及通過抑制SIRT1選擇性靶向白血病干細(xì)胞治療提供了實驗基礎(chǔ)。第二部分：EZH1基因產(chǎn)物具有賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性,介導(dǎo)H3K27甲基化,AML1-ETO能夠結(jié)合EZH1基因啟動子區(qū)AML1位點導(dǎo)致EZH1的異常轉(zhuǎn)錄激活,通過組蛋白甲基化改變其他基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài),活化細(xì)胞周期和增殖,引起表觀遺傳學(xué)改變參與白血病發(fā)生發(fā)展,明確EZH1基因的AML1-ETO作用位點為新的臨床治療方法提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：AML1-ETO SIRT1 EZH1 表觀遺傳學(xué) 基因表達(dá)調(diào)控 熒光素酶報告基因 AML
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.71
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 引言12-20
• 第一節(jié) 急性髓系白血病的研究背景12-14
• 1 急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展12
• 2 t(8;21)急性髓系白血病12-14
• 第二節(jié) SIRT蛋白家族的研究背景14-16
• 1 Sirtuins蛋白家族的來源和結(jié)構(gòu)14
• 2 Sirtuins蛋白家族的功能14-16
• 第三節(jié) EZH1的研究背景16-20
• 1 組蛋白甲基化16-17
• 2 EZH1的來源和功能17-20
• 第一部分 AML1-ETO融合基因?qū)IRT1基因表達(dá)調(diào)控的機理研究20-40
• 第一節(jié) 研究方法20-32
• 一 研究對象20
• 二 實驗儀器20-21
• 三 實驗試劑21-23
• 四 溶液配制23
• 五 實驗方法23-32
• 第二節(jié) 結(jié)果32-37
• 一 AML1-ETO靶向調(diào)控SIRT132
• 二 SIRT1核心啟動子區(qū)域的定位32-35
• 三 AML1-ETO對SIRT1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控35-37
• 第三節(jié) 討論37-39
• 第四節(jié) 結(jié)論39-40
• 第二部分 AML1-ETO融合基因?qū)ZH1基因表達(dá)調(diào)控的機理研究40-55
• 第一節(jié) 研究方法40-49
• 一 研究對象40
• 二 實驗儀器40
• 三 實驗試劑40-41
• 四 溶液配制41-43
• 五 實驗方法43-49
• 第二節(jié) 結(jié)果49-53
• 一 AML1-ETO靶向調(diào)控EZH149-50
• 二 AML1-ETO融合蛋白結(jié)合EZH1核也、啟動子區(qū)域的位點調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄50-52
• 三 EZH1基因在AML1-ETO陽性白血病中的作用52-53
• 第三節(jié) 討論53-55
• 第四節(jié) 結(jié)論55
• 小結(jié)55-56
• 附表56-58
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 文獻(xiàn)綜述62-68
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況68-69
• 致謝69

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9 白莉;祝蓉;陳智鴻;白春學(xué);高磊;張新;;靶向EGFR基因的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建及其生物學(xué)效應(yīng)的研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年23期

10 崔曉萍,應(yīng)大君,李黔寧;反基因寡核苷酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞組織因子表達(dá)的體外研究[J];心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2004年04期

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1 張業(yè);抑癌基因產(chǎn)物p53在熱休克蛋白基因表達(dá)調(diào)控中的作用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2000年

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本文編號：526963