本文關(guān)鍵詞：URI促進(jìn)胃癌細(xì)胞阿霉素耐藥性和細(xì)胞遷移

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【摘要】：研究背景:胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在導(dǎo)致死亡的腫瘤中排第二。超過70%的診斷和死亡發(fā)生于發(fā)展中國家,尤其以中國的發(fā)病率最高。早期胃癌的治療常采取外科手術(shù)切除,但是大部分胃癌被確診時已經(jīng)是晚期,并且發(fā)生了轉(zhuǎn)移,錯過了手術(shù)治療的最佳時間。晚期患者預(yù)后不良,五年生存率不到15%。為了改善其生命質(zhì)量和延長生命,聯(lián)合化療是最主要的方法。由于藥物抵抗及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,胃癌病人的預(yù)后不容樂觀。因此,需要尋找有效可行的方法來解決胃癌對化療藥物抵抗和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等問題。非常規(guī)前折疊素RPB5作用因子URI,是RNA聚合酶II亞型5的作用蛋白,參與營養(yǎng)敏感m TOR依賴的轉(zhuǎn)錄程序的調(diào)控,多項研究已經(jīng)表明URI是一個癌蛋白。然而,URI是否在胃癌腫瘤形成中起作用目前還未闡明。在胃癌細(xì)胞中,PI3K/Akt/m TOR通路過表達(dá),對胃癌的預(yù)后具有潛在意義。本文我們探索URI對胃癌細(xì)胞MGC-803和HGC-27的作用,主要針對阿霉素抵抗和細(xì)胞遷移及其機(jī)制的研究。研究目的:本文研究URI對MGC-803和HGC-27細(xì)胞生物學(xué)特征的作用,主要探索URI對胃癌細(xì)胞阿霉素耐藥性和遷移能力的影響。研究方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng)胃癌細(xì)胞MGC-803培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基內(nèi),HGC-27細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中均含10%胎牛血清及1%青霉素和鏈霉素的混合物,細(xì)胞于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中對數(shù)生長。(2)過表達(dá)或敲低URI免疫印跡法檢測SGC-7901、HGC-27、MGC-803和BGC-823細(xì)胞URI的表達(dá),選擇MGC-803和HGC-27細(xì)胞進(jìn)行下一步實驗。過表達(dá)胃癌細(xì)胞URI采用脂質(zhì)體2000瞬時轉(zhuǎn)染URI表達(dá)質(zhì)粒p CMV6-URI,敲低細(xì)胞URI通過瞬轉(zhuǎn)URI干擾片段si RNA-A、si RNA-B和si RNA-C實現(xiàn)。熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法用于檢測URI在m RNA和蛋白水平的表達(dá)。(3)細(xì)胞增殖實驗CCK-8法檢測URI過表達(dá)和敲低后,在有無阿霉素作用下的細(xì)胞增殖。(4)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及凋亡分析蛋白免疫印跡法檢測過表達(dá)和敲低URI凋亡相關(guān)蛋白的水平,流式細(xì)胞技術(shù)檢測阿霉素處理下敲低URI細(xì)胞的凋亡。(5)細(xì)胞遷移實驗Transwell小室實驗了解轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移能力,免疫印跡法檢測EMT相關(guān)蛋白Vimentin和Snail的表達(dá)。研究結(jié)果:(1)URI在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)免疫印跡法顯示四株胃癌細(xì)胞均有URI表達(dá),我們選擇低分化的MGC-803細(xì)胞和未分化的HGC-27細(xì)胞進(jìn)行接下來的實驗。轉(zhuǎn)染p CMV6-URI質(zhì)粒細(xì)胞的URI表達(dá)明顯升高,轉(zhuǎn)染URI si RNA干擾片段細(xì)胞URI的水平顯著降低,其中URI si RNA-A的敲低效果最強(qiáng)。(2)URI促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染p CMV6-URI過表達(dá)URI促進(jìn)兩株細(xì)胞的增殖,敲低URI顯著減弱細(xì)胞增殖。(3)URI拮抗阿霉素對細(xì)胞增生的抑制,減弱其誘導(dǎo)的凋亡CCK-8試劑盒用于檢測細(xì)胞的增殖。轉(zhuǎn)染p CMV6-URI細(xì)胞阿霉素的IC50值明顯增高,敲低URI其值降低。阿霉素處理后,過表達(dá)URI細(xì)胞的Bax/Bcl-2相對比值、裂解的PARP-1和Caspase-3水平均降低。相反,敲低URI增加兩株細(xì)胞Bax/Bcl-2相對比值、裂解的PARP-1和Caspase-3的水平。與對照組相比,阿霉素處理敲低URI的細(xì)胞,早期凋亡(Annexin V+/PI-)在兩株細(xì)胞中均顯著增加。(4)URI促進(jìn)細(xì)胞遷移能力及增加Vimentin和Snail的表達(dá)在兩株胃癌細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染p CMV6-URI增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力,引起EMT標(biāo)志物Vimentin和Snail的表達(dá)增加。轉(zhuǎn)染URI si RNA減弱細(xì)胞遷移,Vimentin和Snail的表達(dá)均顯著減低。結(jié)論:(1)URI能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖能力。(2)URI通過促進(jìn)細(xì)胞增殖增強(qiáng)藥物抵抗,通過Caspase依賴的方式抑制細(xì)胞凋亡。(3)URI可能通過上調(diào)EMT相關(guān)蛋白Vimentin和Snail的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移。
【關(guān)鍵詞】：URI 胃癌細(xì)胞 藥物抵抗 阿霉素 細(xì)胞遷移
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-14
• 英文縮略詞表14-18
• 第一章 緒論18-25
• 1.1 URI基因18-19
• 1.2 URI與多種惡性腫瘤之間的關(guān)系19-22
• 1.2.1 URI與肝癌19-20
• 1.2.2 URI與卵巢癌20-21
• 1.2.3 URI與多發(fā)性骨髓瘤21
• 1.2.4 URI與宮頸癌21-22
• 1.3 胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與預(yù)后22-24
• 1.4 結(jié)語24-25
• 第二章 URI干預(yù)胃癌細(xì)胞的構(gòu)建25-43
• 2.1 實驗材料和儀器25-29
• 2.1.1 實驗試劑25-26
• 2.1.2 實驗耗材26-27
• 2.1.3 實驗儀器27-28
• 2.1.4 相關(guān)試劑的配制28-29
• 2.2 方法29-38
• 2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇29-30
• 2.2.2 細(xì)胞傳代30
• 2.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染30-32
• 2.2.4 熒光定量PCR分析32-35
• 2.2.5 蛋白印記法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)35-38
• 2.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析38
• 2.3 結(jié)果38-42
• 2.3.1 Western blotting分析四株胃癌細(xì)胞URI的表達(dá)38
• 2.3.2 q RT-PCR檢測干預(yù)胃癌細(xì)胞URI在m RNA水平的表達(dá)38-40
• 2.3.3 Western Blotting檢測干預(yù)胃癌細(xì)胞URI的蛋白水平40-42
• 2.4 討論42-43
• 第三章 過表達(dá)或敲低URI影響胃癌細(xì)胞增殖以及對阿霉素的抵抗43-51
• 3.1 實驗材料和相關(guān)儀器43-44
• 3.1.1 實驗試劑43
• 3.1.2 實驗耗材和儀器43
• 3.1.3 阿霉素儲存濃度的制備43-44
• 3.2 方法44-45
• 3.2.1 CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞活力44
• 3.2.2 檢測干預(yù)后MGC-803 和HGC-27 細(xì)胞對阿霉素的抵抗44-45
• 3.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析45
• 3.3 實驗結(jié)果45-49
• 3.3.1 過表達(dá)和敲低URI對MGC-803 和HGC-27 細(xì)胞增殖的影響45-46
• 3.3.2 干預(yù)URI影響胃癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥性46-49
• 3.4 討論49-51
• 第四章 阿霉素處理下URI對胃癌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制51-57
• 4.1 實驗材料和儀器51-52
• 4.1.1 實驗試劑51
• 4.1.2 主要耗材51
• 4.1.3 實驗儀器51-52
• 4.2 實驗方法52
• 4.2.1 免疫印跡法52
• 4.2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡52
• 4.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析52
• 4.3 實驗結(jié)果52-55
• 4.3.1 URI調(diào)控阿霉素作用后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)52-54
• 4.3.2 URI調(diào)控阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡54-55
• 4.4 討論55-57
• 第五章 URI對胃癌細(xì)胞遷移的影響及機(jī)制57-63
• 5.1 實驗材料和儀器57
• 5.1.1 實驗試劑57
• 5.1.2 實驗耗材57
• 5.1.3 實驗儀器57
• 5.2 實驗方法57-58
• 5.2.1 Transwell小室實驗57-58
• 5.2.2 免疫印跡法檢測遷移相關(guān)蛋白Vimentin和Snail的表達(dá)58
• 5.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析58
• 5.3 實驗結(jié)果58-61
• 5.3.1 Transwell檢測干預(yù)URI胃癌細(xì)胞遷移能力的變化58-60
• 5.3.2 URI對EMT相關(guān)蛋白Vimentin和Snail表達(dá)的調(diào)節(jié)60-61
• 5.4 討論61-63
• 結(jié)論與展望63-64
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 致謝72-73
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文73

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