本文關(guān)鍵詞：ARNO介導(dǎo)BCR-ABL-ARF6信號(hào)及促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞耐藥的初步研究

  更多相關(guān)文章： 慢性粒細(xì)胞白血病 ARNO ARF6 耐藥

【摘要】：背景:慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種粒細(xì)胞增生性疾病,占成人白血病的20%。CML病人的主要病因是9號(hào)和22號(hào)染色體易位產(chǎn)生BCR-ABL融合基因,編碼一個(gè)210k Da持續(xù)活化的酪氨酸激酶,誘導(dǎo)CML的產(chǎn)生。針對(duì)BCR-ABL開(kāi)發(fā)的酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)類靶向藥物(譬如Imatinib)取得了較好的臨床療效,已經(jīng)取代骨髓移植成為首選治療方案。但I(xiàn)matinib并不能治愈CML,長(zhǎng)期服用Imatinib容易引起B(yǎng)CR-ABL基因突變和耐藥基因的高表達(dá)而對(duì)藥物產(chǎn)生抗性,使CML從慢性期進(jìn)入加速期,或轉(zhuǎn)為急性白血病使病情難以控制,因此,闡明CML的耐藥機(jī)制或發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)對(duì)未來(lái)CML的診療具有重要意義。ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factors,ARFs)是真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)且高度保守的GTP結(jié)合蛋白,是Ras超家族成員之一。先前的實(shí)驗(yàn)中,將Arf6進(jìn)行干擾,降低K562細(xì)胞中ARF6蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞的增殖和耐藥能力顯著下降。所以我們初步推測(cè)ARF6在BCR-ABL誘導(dǎo)的CML中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ARNO(ARF nucleotide-binding-site opener)是目前報(bào)道最多的催化ARF6的鳥(niǎo)苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs)。我們通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了RNA水平K562中ARF6活化所需的GEFs表達(dá)。在四種GEFs蛋白(Cytohesin 1、ARNO、Grp1和Cytohesin 4)中,ARNO的表達(dá)量明顯高于其他蛋白,提示在CML中,起催化作用的可能也是ARNO。我們結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,對(duì)ARF6上游和下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行了歸納和預(yù)測(cè),BCR-ABL通過(guò)磷酸化ARNO促進(jìn)了ARF6的活化,介導(dǎo)下游信號(hào)通路,調(diào)控靶基因(c-myc、cyclin B1、p21、MDR1和TERT等)的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)CML的增殖與耐藥。為了驗(yàn)證這種推測(cè),本課題構(gòu)建了有ARNO突變體(Y6F、Y326F、Y381F、E156K)的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過(guò)co-IP、Western blot等方法闡明BCR-ABL磷酸化ARNO促進(jìn)ARF6活化的分子機(jī)制。另外用Secin H3(ARNO抑制劑)處理K562細(xì)胞,檢測(cè)了ARNO對(duì)K562細(xì)胞耐藥的影響。方法:1.利用點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建ARNO突變質(zhì)粒表達(dá)載體,和BCR-ABL表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。2.利用co-IP、Western blot檢測(cè)ARNO的磷酸化水平,ARF6-GTP 水平。3.Secin H3處理K562細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ARNO對(duì)K562細(xì)胞耐藥的影響。結(jié)果:1.co-IP、Western blot結(jié)果顯示在三種ARNO突變體中,Y326F突變體的ARNO磷酸化水平和Arf6-GTP較低,與陰性對(duì)照E156K相似,推測(cè)BCR-ABL磷酸化ARNO的326位酪氨酸進(jìn)而活化ARF6。2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示K562細(xì)胞經(jīng)Secin H3處理后細(xì)胞凋亡率明顯增加,對(duì)Imatinib的耐藥性減弱,說(shuō)明Secin H3抑制ARNO的活性后增強(qiáng)了Imatinib的藥效,ARNO使K562對(duì)Imatinib的敏感性增強(qiáng)。結(jié)論:BCR-ABL磷酸化ARNO的326位酪氨酸進(jìn)而活化ARF6;ARNO使K562對(duì)Imatinib的敏感性增強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：慢性粒細(xì)胞白血病 ARNO ARF6 耐藥
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.72
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-17
• 1.1 慢性粒細(xì)胞白血病簡(jiǎn)介11-12
• 1.1.1 CML的治療進(jìn)展11
• 1.1.2 CML的耐藥研究11-12
• 1.2 ARNO的研究進(jìn)展12-14
• 1.2.1 ARNO在上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)型中的作用12-13
• 1.2.2 ARNO在RalBP1/RLIP76通路介導(dǎo)的細(xì)胞遷移中的作用13-14
• 1.2.3 ARNO在結(jié)腸癌中的作用14
• 1.3 ARF6的研究進(jìn)展14-15
• 1.4 ARNO-ARF6與慢性粒細(xì)胞白血病15-17
• 第2章 材料與方法17-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17-20
• 2.1.1 主要生化和分子生物學(xué)試劑17-19
• 2.1.2 器材和主要儀器19-20
• 2.1.3 細(xì)胞20
• 2.1.4 質(zhì)粒及載體20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-37
• 2.2.1 PCR方法檢測(cè)K562和 293T細(xì)胞ARNO基因20-22
• 2.2.2 Netphos2.0 Server軟件分析ARNO酪氨酸磷酸化位點(diǎn)22
• 2.2.3 ARNO表達(dá)載體的構(gòu)建22-25
• 2.2.4 ARNO表達(dá)載體的點(diǎn)突變25-26
• 2.2.5 構(gòu)建MSCV-puro-ARNO載體26-28
• 2.2.6 驗(yàn)證MSCV-puro-ARNO載體的表達(dá)28-32
• 2.2.7 MigrI-BCR-ABL和MSCV-puro-ARNO共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞32-33
• 2.2.8 ARNO對(duì)K562細(xì)胞耐藥的影響33-34
• 2.2.9 構(gòu)建pLenti-III-ubc-ARNO重組載體34-35
• 2.2.10 驗(yàn)證pLenti-III-ubc-ARNO載體在 293T細(xì)胞的表達(dá)35-36
• 2.2.11 包裝ubc-ARNO慢病毒36-37
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-47
• 3.1 ARNO在K562中的表達(dá)及磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)37-38
• 3.2 ARNO突變體的構(gòu)建（以突變體Y381F為例）38-41
• 3.3 ARNO突變載體的驗(yàn)證41-42
• 3.4 ARNO磷酸化位點(diǎn)的確定42-45
• 3.5 ARNO活性的抑制增強(qiáng)IMATINIB的藥效45
• 3.6 ARNO慢病毒載體的構(gòu)建45-47
• 第4章 討論47-50
• 第5章 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 致謝57

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 鄭晨宏;梁后杰;周琪;;黏附分子在腫瘤多細(xì)胞耐藥中的研究進(jìn)展[J];腫瘤;2008年07期

2 周中軍，，金順錢，羅賢懋，陳鳳，魏慧娟;谷胱甘肽－硫轉(zhuǎn)移酶在肺癌細(xì)胞耐藥中的作用[J];生物化學(xué)雜志;1996年02期

3 梁后杰;重視對(duì)腫瘤多細(xì)胞耐藥的研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2003年03期

4 梁后杰,黃海輝;細(xì)胞粘附與腫瘤多細(xì)胞耐藥[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年11期

5 梁后杰,黃海輝;細(xì)胞黏附介導(dǎo)的腫瘤多細(xì)胞耐藥[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年24期

6 張敏;吳耀輝;陳智超;游泳;鄒萍;;Chk1在K562/A02細(xì)胞耐藥中的作用機(jī)制[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年05期

7 丁玉峰,胡群;白血病細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制和藥物逆轉(zhuǎn)[J];中國(guó)藥師;2005年02期

8 肖潔;尹松梅;謝雙鋒;聶大年;李益清;馬麗萍;王秀菊;馮堅(jiān)紅;;細(xì)胞調(diào)控因子SKP2的表達(dá)與HL-60/A耐藥的關(guān)系[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2009年02期

9 敖緒軍;安江宏;錢莘;卓文磊;孫建國(guó);陳正堂;;Sca-1~+Lewis肺癌細(xì)胞耐藥實(shí)驗(yàn)研究[J];四川醫(yī)學(xué);2008年05期

10 黃偉,張瑤珍,李登舉,周劍鋒;線粒體參與HL-60細(xì)胞耐藥機(jī)制的研究[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年03期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

1 王曉芳;王椿;秦尤文;顏式可;高彥榮;蔡琦;;聯(lián)合抑制泵蛋白和抗凋亡蛋白逆轉(zhuǎn)HL-60/ADR細(xì)胞耐藥[A];第10屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

2 張嵩;劉曉力;杜慶鋒;樊偉;;STI571誘導(dǎo)K562細(xì)胞耐藥的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)血液學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

3 樸瑛;劉麗梅;周凡;劉彥琴;劉景華;白穎;;Bcl-2小干擾RNA對(duì)HL-60/VCR細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究[A];第10屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

4 張嵩;劉曉力;杜慶鋒;樊偉;;STI571誘導(dǎo)K562細(xì)胞耐藥的實(shí)驗(yàn)研究[A];第10屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

5 陳信義;鄭智;侯麗;李冬云;;復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合阿霉素影響K562/A02移植瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)酶表達(dá)研究[A];2009年首屆全國(guó)中西醫(yī)腫瘤博士及中青年醫(yī)師論壇論文集[C];2009年

6 馮戈;王大章;何嘉;冷衛(wèi)東;鄭光勇;陳槐卿;;舌癌Tca8113細(xì)胞耐藥裸鼠誘發(fā)瘤模型的探討[A];第二屆全國(guó)口腔頜面—頭頸腫瘤內(nèi)科綜合治療研討會(huì)論文匯編[C];2006年

7 楊永紅;李惠芳;石永進(jìn);王逸群;張英;王奕嘉;朱平;;轉(zhuǎn)mdrl基因誘導(dǎo)CIK細(xì)胞耐藥并保持腫瘤殺傷活性[A];第三屆全國(guó)血液免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2003年

8 楊永紅;李惠芳;石永進(jìn);王逸群;張英;朱平;;轉(zhuǎn)MDR1基因誘導(dǎo)CIK細(xì)胞耐藥并保持腫瘤殺傷活性[A];第九屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

9 張毅;王小燕;閆海釗;劉雨婷;蔡君;王懷玲;王一飛;;Hsp90抑制劑BJ-B11逆轉(zhuǎn)白血病干細(xì)胞耐藥的機(jī)制研究[A];廣東省生物物理學(xué)會(huì)2013年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 趙寶霞;EGFR突變型NSCLC的EGFR-TKI耐藥機(jī)制體外研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

2 夏青;DATS逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞耐藥的機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2012年

3 白慶咸;bcl-x基因在惡性淋巴造血組織的表達(dá)及其對(duì)白血病細(xì)胞凋亡易感性與化療敏感性的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1998年

4 王以;藥物轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞模型的建立、應(yīng)用和相關(guān)機(jī)制的初步研究[D];浙江大學(xué);2005年

5 高愛(ài)麗;大環(huán)內(nèi)酯類化合物逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞（MCF-7/adr）多藥耐藥性的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 彭方毅;模擬缺血再灌注損傷誘導(dǎo)Hepg2細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)及意義[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

2 李麗君;胞質(zhì)M-CSF通過(guò)抑制HIF-1α/BNIP3/Bax信號(hào)通路增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡抗性[D];南華大學(xué);2015年

3 張建一;酸性絲氨酸蛋白酶ASP_(NJ)抗急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞作用與膜蛋白表達(dá)相關(guān)機(jī)制[D];吉林大學(xué);2016年

4 徐倩;ARNO介導(dǎo)BCR-ABL-ARF6信號(hào)及促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞耐藥的初步研究[D];吉林大學(xué);2016年

5 李娟;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)蛋白1表達(dá)的研究[D];江蘇大學(xué);2010年

6 高飛;拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα的表達(dá)對(duì)人肺癌細(xì)胞耐藥的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2010年

7 謝佳;DSCs細(xì)胞的生物學(xué)特性及對(duì)裸鼠移植瘤的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

8 黃海輝;E-鈣粘素及PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤多細(xì)胞耐藥中作用機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2003年

9 高燕芳;iASPP和CDKL1的表達(dá)及其沉默對(duì)腫瘤細(xì)胞生物活性的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2012年

10 張嵩;STI571誘導(dǎo)K562細(xì)胞耐藥機(jī)制的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

本文編號(hào)：524338