本文關(guān)鍵詞：胃蛋白酶在喉癌中的表達(dá)及作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的和意義喉癌是耳鼻咽喉科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,90%以上為鱗狀細(xì)胞癌,占全身惡性腫瘤的1%～5%,占頭頸腫瘤的30%-50%,近年喉癌的發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)根據(jù)近30年的數(shù)據(jù)指出喉癌是所有惡性腫瘤五年生存率唯一未得到提高的腫瘤。除了喉癌公認(rèn)的危險(xiǎn)因素吸煙與酗酒外,有學(xué)者認(rèn)為咽喉反流可能是喉癌發(fā)病的協(xié)同因素。為了有效的預(yù)防喉癌的發(fā)生,對(duì)喉癌危險(xiǎn)因素的研究至關(guān)重要。咽喉反流(Larynghopharyngeal reflux, LPR)是指胃內(nèi)容物反流至食管上括約肌以上部位,引起一系列咽喉部癥狀和體征的總稱(chēng),研究證實(shí)咽喉反流與慢性咽喉炎、聲帶息肉、阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征、慢性咳嗽、小兒分泌性中耳炎等咽喉部良性疾病密切相關(guān)。近年來(lái),咽喉反流是否參與喉癌發(fā)生和發(fā)展受到了學(xué)界越來(lái)越多的關(guān)注,部分文獻(xiàn)報(bào)道喉癌患者中咽喉反流的發(fā)生率為54-88.7%不等,認(rèn)為咽喉反流是咽喉鱗癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,但也有文獻(xiàn)不支持這個(gè)觀點(diǎn),圍繞咽喉反流在喉癌發(fā)生和發(fā)展中的作用和意義仍有很多爭(zhēng)論。胃蛋白酶(Pepsin)是胃食管反流物的主要成分,由胃壁主細(xì)胞分泌的胃蛋白酶原,在胃內(nèi)酸性條件下自我轉(zhuǎn)化而成的活性形式,它是消化系統(tǒng)中必不可缺的蛋白水解酶,同時(shí)也是咽喉反流中主要的侵襲成分。Pepsin可通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入咽喉黏膜細(xì)胞,儲(chǔ)存于細(xì)胞囊泡,并運(yùn)送至線粒體和高爾基體內(nèi),使線粒體變體腫脹,線粒體脊變淺,高爾基體成空泡狀,損傷咽喉部粘膜細(xì)胞。同時(shí),Pepsin亦可通過(guò)抑制咽喉黏膜細(xì)胞保護(hù)蛋白(如上皮細(xì)胞應(yīng)激蛋白Sep70/Sep53,上皮表面保護(hù)性蛋白-粘蛋白Mucin等)的正常表達(dá),加重胃酸對(duì)咽喉粘膜的損傷。Pepsin在pH2的酸性環(huán)境下活性最大,而在pH2-6.5時(shí)仍有活性可對(duì)對(duì)咽喉粘膜造成傷害。pH達(dá)到6.5以上時(shí),Pepsin雖然處于無(wú)活性狀態(tài),但仍保留其穩(wěn)定性,當(dāng)周?chē)h(huán)境pH再次因咽喉反流事件而降至酸性條件時(shí),可再次活化,因而具有潛在的損傷力。只有當(dāng)pH8時(shí),Pepsin才能永久性失活。Pepsin長(zhǎng)期反復(fù)刺激可引起喉上皮損害以及結(jié)構(gòu)改變,使得咽喉黏膜處于慢性炎癥狀態(tài),啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答而釋放炎癥因子(如IL-1、IL-6、IL-8、活性氧類(lèi)等)。既往的大量文獻(xiàn)已證實(shí),這些炎癥因子可形成特殊微環(huán)境,不僅直接誘導(dǎo)正常細(xì)胞中的原癌、抑癌基因突變,使正常細(xì)胞發(fā)生癌變,還可促進(jìn)腫瘤的增殖、抗凋亡、遷移、血管發(fā)生,使其發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化,使癌癥進(jìn)一步惡化。但是,Pepsin是否參與喉癌的發(fā)生發(fā)展,使喉癌進(jìn)一步惡化還未有深入研究,其具體機(jī)制尚需探討。上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)指上皮細(xì)胞在特定的生理及病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象,表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去極性,與周?chē)?xì)胞和基質(zhì)間的黏附能力減小,遷移性和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),因此,EMT可促使一些參與基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)降解和破壞的溶解酶分泌,從而破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障,便于細(xì)胞分離脫落,從而發(fā)生遷移轉(zhuǎn)移,目前對(duì)EMT參與腫瘤發(fā)生發(fā)展成為研究的熱點(diǎn)。近期有文獻(xiàn)指出,咽喉反流可能參與EMT過(guò)程,能使EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)缺失以及間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的上調(diào),認(rèn)為EMT與咽喉反流嚴(yán)重程度相關(guān)。然而,EMT在咽喉反流與喉癌之間的作用目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道鮮有報(bào)道。那么咽喉反流及其中的主要成分Pepsin是否通過(guò)EMT參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程,促進(jìn)喉癌的增殖、轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)程值得進(jìn)一步研究。本課題擬通過(guò)免疫組化檢測(cè)Pepsin在正常喉上皮組織、聲帶白斑組織及喉癌組織中的表達(dá)特性,與24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè)參數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析,探討Pepsin是否參與喉癌發(fā)病,同時(shí)探討喉癌發(fā)病中Pepsin與不同反流事件的關(guān)系和特點(diǎn),以及比較組織中Pepsin免疫組化和24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè)診斷咽喉反流陽(yáng)性率；在體外實(shí)驗(yàn)中,我們進(jìn)一步以不同濃度、不同pH的Pepsin刺激喉癌細(xì)胞,觀察Pepsin對(duì)喉癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其在喉癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的重要作用；我們利用熒光定量PCR和Western Blotting技術(shù)檢測(cè)喉癌細(xì)胞在Pepsin刺激后多個(gè)上皮、間質(zhì)標(biāo)志物的變化情況,從而證實(shí)Pepsin是否誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞發(fā)生EMT,為深入理解咽喉反流是否參與喉癌發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。材料和方法1.臨床標(biāo)本收集18例聲帶白斑組織和21例喉癌組織均取自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院因聲帶白斑及喉癌(T1-3N1M0)擬行手術(shù)治療的患者,手術(shù)中取喉病變組織標(biāo)本,所有患者均尚未接受放化療治療。16例健康喉上皮組織在南方醫(yī)院耳鼻喉科門(mén)診表麻纖維電子喉鏡下取聲帶近室?guī)幱坞x緣處組織,所有受試者要求檢查前2周內(nèi)無(wú)服用質(zhì)子泵抑制劑、促胃腸動(dòng)力藥物。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者及健康志愿者均自愿加入且簽署參與研究的知情同意書(shū)。2.24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè)：采用ZepHr多通道腔內(nèi)阻抗-pH監(jiān)測(cè)便攜系統(tǒng)(Sandhill scientific inc,美國(guó))及型號(hào)ZAI-BL-48E單根分叉型電極,電極直徑2.3 mm,共有6個(gè)阻抗通道,分別位于LES上方3 cm、5 Cm、7 cm、9 cm以及UES下方3 cm、5 cm；2個(gè)pH監(jiān)測(cè)位點(diǎn)分別位于LES上方5 cm和UES上方1 cm。監(jiān)測(cè)電極使用前均行pH 4.0和pH 7.0校準(zhǔn)液定標(biāo)校準(zhǔn)。監(jiān)測(cè)前患者禁食水至少8 h,取臥位,經(jīng)鼻插入監(jiān)測(cè)導(dǎo)管,根據(jù)食管動(dòng)力監(jiān)測(cè)定位LES位置,胸前固定外置參考電極。調(diào)整ZepHr多通道腔內(nèi)阻抗-pH監(jiān)測(cè)便攜系統(tǒng)開(kāi)始記錄咽喉反流及胃食管反流數(shù)據(jù)。告知患者注意事項(xiàng),囑其次日同一時(shí)間返回檢查室(保證檢查時(shí)間大約24 h),拆除儀器,結(jié)束檢查。監(jiān)測(cè)記錄數(shù)據(jù)處理采用Bioview反流分析軟件(Sandhill Scientific),輸出反流波形圖和反流數(shù)據(jù)報(bào)告。24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè)結(jié)果判讀：咽喉酸反流次數(shù)≥2次為咽喉反流陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),DeMeester≥14.7分為胃食管反流陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。3.免疫組化將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉、抗體孵育、DAB顯色、復(fù)染、透明、封片等步驟進(jìn)行,免疫組化的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量判定。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,按鱗狀上皮細(xì)胞或鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的胞漿顯色深淺評(píng)分,無(wú)顯色為陰性記0分,淺褐色為弱陽(yáng)性記1分,棕褐色為陽(yáng)性記2分,顆粒狀深棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性記3分；按顯色組織的比例評(píng)分：顯色25%為1分,顯色25%～50%為2分,顯色51%～75%為3分,顯色75%為4分。根據(jù)二者的乘積將顯色程度分為4級(jí),0分為陰性記0級(jí),1～4分為弱陽(yáng)性記1級(jí),5～8分為陽(yáng)性記2級(jí),9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性記3級(jí)。4.細(xì)胞培養(yǎng)人喉癌細(xì)胞株Hep-2,采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)。采用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。5.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)5.1 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將1×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,分三組,每孔體積200μl,每組5孔,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照,三組分別加入pH7無(wú)Pepsin培養(yǎng)基、Pepsin 0.1mg/ml培養(yǎng)基和Pepsin 1mg/ml培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)0.5h、1.5h、3h、6h、15h、24h、36h。每孔加入CCK-8溶液10μl,37℃孵育2h后終止孵育,以空白對(duì)照孔調(diào)零,酶標(biāo)儀上450nm測(cè)定各孔吸光度值(OD值),以相對(duì)應(yīng)OD比值表示細(xì)胞增殖能力大小。細(xì)胞存活率%=(加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD)×100%。5.2平板克隆形成實(shí)驗(yàn)接種100個(gè)細(xì)胞到12孔板中,每種濃度Pepsin培養(yǎng)基條件(pH7無(wú)Pepsin培養(yǎng)基、Pepsin 0.1mg/ml培養(yǎng)基和Pepsin lmg/ml培養(yǎng)基)重復(fù)3孔,保證細(xì)胞分散均勻,培養(yǎng)18天。出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆時(shí),終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基,多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)(芝50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆)。平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。5.3細(xì)胞周期檢測(cè)采用碘化丙錠(propidium iodide, PI)單染法檢測(cè)細(xì)胞加入不同濃度Pepsin培養(yǎng)基(pH7無(wú)Pepsin培養(yǎng)基、Pepsin 0.1mg/ml培養(yǎng)基和Pepsin lmg/ml培養(yǎng)基)刺激24h后細(xì)胞周期分布。將細(xì)胞固定、Rnase A消化、PI染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。5.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將密度為5×105/ml的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,不同濃度Pepsin培養(yǎng)基條件(pH7無(wú)Pepsin、Pepsin O.lmg/ml和Pepsin lmg/ml)分三組,用200g1無(wú)菌槍頭在每個(gè)孔中迅速而輕輕地劃2-3道痕。劃痕后Oh、24h、48h倒置顯微鏡下拍照,應(yīng)用ImageJ軟件測(cè)量細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的距離。5.5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞重懸于無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,每個(gè)Transwell小室中加入細(xì)胞,培養(yǎng)板每孔加入10%胎牛血清及不同濃度Pepsin(pH7無(wú)Pepsin、Pepsin 0.1mg/ml和Pepsin lmg/ml)培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后取出Transwell小室,固定染色顯微鏡下觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞。6. Pepsin刺激喉癌發(fā)生EMT：6.1 Pepsin和EMT標(biāo)志物在喉癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性免疫組化檢測(cè)80例喉癌中EMT上皮標(biāo)志物(E-cadherin)和間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、β-catenine)的表達(dá)情況,分析其與Pepsin相關(guān)性。6.2熒光定量PCR抽提細(xì)胞和組織的總RNA和小分子RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用sybrgreen法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)相對(duì)定量以2一△△Ct值測(cè)定EMT上皮標(biāo)志物(E-cadherin)和間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、β-catenine)的mRNA表達(dá)情況。6.3 Western blot抽提細(xì)胞總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,然后10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、化學(xué)發(fā)光法顯影,檢測(cè)EMT上皮標(biāo)志物(E-cadherin)和間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、β-catenine)蛋白水平表達(dá)情況。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。免疫組化強(qiáng)度比較中采用獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)方法；雙變量相關(guān)分析中,對(duì)非雙變量正態(tài)分布資料選擇Spearman相關(guān)分析；CCK-8實(shí)驗(yàn)采用析因設(shè)計(jì)的方差分析,細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕損傷實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、熒光定量PCR三組數(shù)據(jù)比較時(shí)采用單因素方差分析,方差齊性時(shí),采用ANOVA,多重比較采用LSD法；方差不齊采用近似F檢驗(yàn)Welch法,多重比較采用Dunnett T3;檢驗(yàn)水平P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、 聲帶白斑、喉癌組和正常對(duì)照組中Pepsin的表達(dá)：聲帶白斑、喉癌組和正常對(duì)照組中Pepsin的表達(dá)定位在鱗狀上皮細(xì)胞或鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞上,以細(xì)胞胞漿表達(dá)為主,少數(shù)可見(jiàn)細(xì)胞核染色。喉癌組織中Pepsin強(qiáng)陽(yáng)性(19.05%)、陽(yáng)性(28.57%)、弱陽(yáng)性(33.33%)、陰性(14.29%)。聲帶白斑組織中Pepsin強(qiáng)陽(yáng)性(5.56%)、陽(yáng)性(38.89%)、弱陽(yáng)性(50.00%)、陰性(5.56%)。正常對(duì)照組中無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性及陽(yáng)性染色,弱陽(yáng)性(31.25%)、陰性(68.75%)。Kruskal-Wallis H(K)秩和檢驗(yàn)分析,三組間Pepsin免疫組化染色評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,喉癌及聲帶白斑組組織中Pepsin免疫組化染色強(qiáng)度均高于正常人群組(P0.01)。組織中Pepsin染色與相應(yīng)24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè)參數(shù)相關(guān)性分析顯示,在喉癌及聲帶白斑組織中,Pepsin評(píng)分與咽喉酸反流立位和總數(shù)的四項(xiàng)參數(shù)(包括酸反流次數(shù)、酸反流時(shí)間、酸反流時(shí)間百分比、平均酸清除時(shí)間)之間有顯著的相關(guān)性(P0.05)。Pepsin評(píng)分和所有食道酸反流參數(shù)(除去pH4時(shí)間平臥位)之間有顯著的相關(guān)性(P0.05)。以24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行咽喉反流及胃食管反流事件評(píng)定,咽喉反流(咽喉探針)在喉癌組、聲帶白斑組及正常組三組間的陽(yáng)性率(LPR+%)分別為33.33%(6/18)、23.81%(5/21)、12.5%(2/16),胃食管反流(食管探針)陽(yáng)性率(GER+%)為22.22%(4/18)、33.33%(7/21)6.25%(1/16),兩者診斷陽(yáng)性率偏低,且數(shù)據(jù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但若以組織中Pepsin免疫組化結(jié)果為咽喉反流診斷標(biāo)準(zhǔn),Pepsin表達(dá)水平≥弱陽(yáng)性為咽喉反流陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),咽喉反流陽(yáng)性率(Pepsin+%)在三組間分別為94.44%(17/18)、80.95%(17/21)、31.25% (5/16),診斷陽(yáng)性率明顯高于24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè),且三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、Pepsin促進(jìn)喉癌細(xì)胞體外增殖、轉(zhuǎn)移。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,加入Pepsin 0.1mg/ml及1mg/ml刺激后,喉癌Hep-2細(xì)胞分別較未加入Pepsin刺激相比體外增殖能力具有顯著差異(F=455.766, P0.001), Pepsin lmg/ml組喉癌Hep-2細(xì)胞體外增殖速度最快,Pepsin 0.1mg/ml組次之。平板克隆結(jié)果表明,加入Pepsin 0.1mg/ml和1mg/ml刺激后,喉癌Hep-2細(xì)胞分別較未加入Pepsin刺激的集落形成數(shù)增加至1.64和3.15倍,喉癌Hep-2細(xì)胞不但克隆數(shù)目顯著增加,而且克隆大小也明顯增加。不同Pepsin濃度組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.696,P=0.022)。細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示,加入不同濃度Pepsin刺激喉癌Hep-2細(xì)胞24h后,隨著加入胃蛋白酶的濃度升高,S期細(xì)胞比例顯著增加(F=410.216,P0.001)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,喉癌Hep-2細(xì)胞劃痕后在不同濃度Pepsin(Omg/ml、 0.1mg/ml和1mg/ml)的刺激下培養(yǎng)24小時(shí)(F=22.406,P=0.002)、48小時(shí)(F=10.349,P=0.011),細(xì)胞的移動(dòng)能力均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,Pepsin濃度的升高(F=-6.506,P0.001),細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的差異具有顯著性。3、Pepsin誘導(dǎo)喉癌發(fā)生EMT：3.1 Pepsin誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞株發(fā)生EMT改變：3.1.1 Pepsin對(duì)喉癌細(xì)胞株形態(tài)學(xué)影響：經(jīng)不同濃度Pepsin刺激5天后,喉癌Hep2細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變。Hep2細(xì)胞株未加入Pepsin組細(xì)胞保持原有細(xì)胞形態(tài)類(lèi)圓形增殖生長(zhǎng),0.1mg/ml Pepsin間斷刺激5天后,Hep2細(xì)胞變?yōu)樗笮紊L(zhǎng),兩端伸出觸角,而加入1mg/ml Pepsin的細(xì)胞株梭形化更加的明顯,細(xì)胞狹長(zhǎng)。說(shuō)明Pepsin可使喉癌Hep2由上皮細(xì)胞表現(xiàn)向間質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)轉(zhuǎn)化。3.1.2 Pepsin誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞株EMT標(biāo)記物改變：熒光定量PCR和Western Blotting分析均顯示,不同濃度Pepsin刺激后Hep2細(xì)胞后,隨著胃蛋白酶濃度的增高,上皮標(biāo)志物E-cadherin下調(diào)而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、β-catenin上調(diào)。3.2Pepsin在喉癌組織中與EMT標(biāo)志物相關(guān)性：經(jīng)Spearman相關(guān)分析,在喉癌中Pepsin表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(Correlation Coefficient=-0.330, P=0.002),與Vimcntin表達(dá)呈正相關(guān)(Correlation Coefficient=0.203, P=0.041),與β-catenin表達(dá)亦呈正相關(guān)(Correlation Coefficient=0.220, P=0.038),同一組織標(biāo)本連續(xù)切片后觀察三個(gè)指標(biāo)不同強(qiáng)度染色情況,可看出隨著Pepsin的增強(qiáng),E-cadherin減弱而Vimentin、β-catenin增強(qiáng)。結(jié)論1.在聲帶白斑、喉癌組織和正常對(duì)照組織上皮胞漿可檢測(cè)到Pepsin表達(dá),經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)喉癌及聲帶白斑組組織中Pepsin免疫組化染色強(qiáng)度均高于正常人群組(P0.01),Pepsin表達(dá)評(píng)分與咽喉酸反流立位和總數(shù)的四項(xiàng)參數(shù)(包括酸反流次數(shù)、酸反流時(shí)間、酸反流時(shí)間百分比、平均酸清除時(shí)間)之間有顯著的正相關(guān)關(guān)系。提示咽喉反流與喉癌相關(guān),其中pepsin起重要作用,可能是喉癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。2.以組織中Pepsin免疫組化結(jié)果為咽喉反流診斷標(biāo)準(zhǔn),聲帶白斑、喉癌組織中診斷陽(yáng)性率明顯高于24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè),且三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,充分說(shuō)明在非酸性條件下,胃蛋白酶依然存在于聲帶白斑、喉癌組織中,以24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè)評(píng)估咽喉反流存在著一定的漏診率, 而應(yīng)用組織中的胃蛋白酶檢測(cè)可以做為一項(xiàng)更好診斷咽喉反流指標(biāo)。3.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Pepsin可增強(qiáng)喉癌細(xì)胞體外增殖、遷移能力,說(shuō)明長(zhǎng)期的Pepsin刺激參與了喉癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,與喉癌的惡性進(jìn)程密切相關(guān)。4.長(zhǎng)期的Pepsin刺激使喉癌細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化,隨著胃蛋白酶濃度的增高,上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào),間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、β-catenin表達(dá)上調(diào)。在喉癌組織免疫組化中Pepsin表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與Vimcntin、β-catenin表達(dá)呈正相關(guān),提示Pepsin很可能通過(guò)EMT在喉癌細(xì)胞的形態(tài)改變及增殖、轉(zhuǎn)移性生物學(xué)行為中扮演重要角色,參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展,促進(jìn)喉癌的惡性進(jìn)程,其具體機(jī)制需今后的研究進(jìn)一步深入探討。
【關(guān)鍵詞】：咽喉反流 胃蛋白酶 喉痛
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R739.65
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 前言24-33
• 參考文獻(xiàn)28-33
• 技術(shù)路線33-34
• 第一章 胃蛋白酶在喉癌組織中的表達(dá)和意義34-48
• 材料與方法34-36
• (一) 研究對(duì)象34-35
• (二) 研究方法35-36
• 結(jié)果36-42
• 一、IHC法檢測(cè)聲帶白斑、喉癌組和正常對(duì)照組中Pepsin的表達(dá)36-38
• 二、組織中Pepsin評(píng)分和24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MⅡ-pH)監(jiān)測(cè)參數(shù)對(duì)比分析38-42
• 三、24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MⅡ-pH)監(jiān)測(cè)與組織中Pepsin免疫組化對(duì)咽喉反流診斷陽(yáng)性率比較42
• 討論42-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 第二章 不同濃度Pepsin對(duì)喉癌細(xì)胞功能的影響48-72
• 材料與方法48-51
• (一) 材料48
• (二) 方法48-51
• 結(jié)果51-67
• 一、不同時(shí)間、不同pH下,不同濃度Pepsin對(duì)喉癌細(xì)胞功能的影響51-61
• 二、在pH7的環(huán)境下不同濃度Pepsin對(duì)喉癌細(xì)胞功能的影響61-67
• 討論67-70
• 參考文獻(xiàn)70-72
• 第三章 Pepsin誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞發(fā)生EMT改變72-86
• 材料與方法72-75
• (一) 材料72
• (二) 方法72-75
• 結(jié)果75-81
• 一、在PH7環(huán)境下不同濃度Pepsin對(duì)喉癌細(xì)胞株形態(tài)學(xué)影響75
• 二、在PH7環(huán)境下不同濃度Pepsin刺激后EMT相關(guān)上皮、間質(zhì)指標(biāo)表達(dá)變化75-77
• 三、免疫組化檢測(cè)Pepsin、EMT上皮標(biāo)記物和間質(zhì)標(biāo)記物在喉癌組織中的表達(dá)77-81
• 討論81-83
• 參考文獻(xiàn)83-86
• 全文小結(jié)86-88
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文88-89
• 英文縮寫(xiě)注解89-90
• 致謝90-92

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