發(fā)布時間：2017-06-30 03:45

  本文關(guān)鍵詞：鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)食管鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥的作用機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:食管癌是一種常見的極具危害性的食管粘膜上皮惡性腫瘤。目前,臨床治療惡性腫瘤的方法是以手術(shù)輔以放化療為主。但惡性腫瘤患者對化療產(chǎn)生耐藥造成多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)引起死亡是臨床上化療治療腫瘤亟待解決難題之一。因此,探討與研發(fā)惡性腫瘤MDR的有效逆轉(zhuǎn)劑,提高惡性腫瘤對臨床一線化療藥物的敏感性,具有極其重要的意義。迄今,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的部分有MDR逆轉(zhuǎn)作用的化合物大多數(shù)由于毒副作用較大,限制了其臨床應(yīng)用。鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride,CEH)是千金藤素(cepharanthine,CEP)經(jīng)半合成成鹽所得到的化合物,CEH具有多種生物活性作用。CEH能否逆轉(zhuǎn)食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的耐藥性且作用機制如何,目前尚未見報道。本實驗擬通過建立內(nèi)外模型考察CEH對腫瘤細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用,并采用細(xì)胞和分子生物學(xué)的方法對其逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的分子機制進(jìn)行深入探討。方法:實驗選擇人食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Eca109及耐順鉑細(xì)胞株Eca109-CDDP,懫用MTT分析法,測定CEH單用及與CDDP合用對Eca109、Eca109-CDDP細(xì)胞的直接細(xì)胞毒作用,并繪制兩藥聯(lián)用抑制率-聯(lián)合指數(shù)圖;Annexin V/PI雙染色法和Western blot檢測細(xì)胞凋亡及與凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)與活化;懫用Western blot和RT-PCR法分別檢測CEH單用及與CDDP合用后,Eca109-CDDP細(xì)胞中P-gp及MDR1 mRNA表達(dá)的變化,考察CEH對順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)作用;采用Western blot法檢測CEH對轉(zhuǎn)錄因子c-Jun蛋白的表達(dá)和活化的影響。將Eca109-CDDP細(xì)胞通過裸鼠腋下接種建立耐藥荷瘤動物模型,觀察CEH在荷瘤小鼠體內(nèi)對腫瘤生長的抑制作用。采用免疫組化法檢測CEH在體內(nèi)干預(yù)后實體瘤中c-Jun和磷酸化c-Jun蛋白表達(dá)水平的變化,采用免疫熒光方法在該模型中研究CEH在體內(nèi)干預(yù)后實體瘤中P-gp蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:1.在1-20.0μM濃度范圍內(nèi),CEH能夠增強CDDP誘導(dǎo)食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,下調(diào)Bcl-2/Bax的比例,增強CDDP誘導(dǎo)的PARP剪切。2.在上述濃度范圍內(nèi),CEH對P-gp及MDR1 mRNA的表達(dá)的抑制作用逐漸增強。即CEH下調(diào)MDR1 mRNA的表達(dá)和P-gp蛋白的表達(dá)呈濃度依賴性;Bcl-2的表達(dá)量逐漸降低而c-Jun、p-c-Jun及JNK的表達(dá)量逐漸增加。3.在2.5-10.0mg/kg濃度范圍內(nèi)的CEH聯(lián)合CDDP的化療方案對食管癌鱗狀細(xì)胞癌荷瘤小鼠的腫瘤生長有不同程度的抑制。與CDDP和CEH單藥組相比,CDDP聯(lián)用CEH組的抑瘤作用增強,且抑瘤作用與CEH呈劑量依賴性,10.0 mg/kg CEH聯(lián)合CDDP化療方案對腫瘤的抑制作用最強。4.CEH在荷瘤小鼠體內(nèi)同樣可以濃度依賴性的下調(diào)P-gp蛋白的表達(dá),增加c-Jun、p-c-Jun及JNK的表達(dá)。結(jié)論:1.CEH在體內(nèi)外都能夠促進(jìn)CDDP對食管癌的增殖的抑制作用,并且能夠促進(jìn)CDDP誘導(dǎo)的食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。2.CEH逆轉(zhuǎn)Eca109-CDDP細(xì)胞的耐藥性作用與降低Bcl-2的表達(dá)、增強c-Jun的表達(dá)和磷酸化有關(guān)。CEH可能是通過活化c-Jun/JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)MDR1mRNA和P-gp的表達(dá),發(fā)揮其逆轉(zhuǎn)食管癌鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥的作用。3.CEH可能是通過抑制P-gp的表達(dá)而發(fā)揮在耐藥性實體型動物腫瘤模型體內(nèi)逆轉(zhuǎn)腫瘤順鉑耐藥的作用。意義:本實驗首次闡明CEH可有效逆轉(zhuǎn)Eca109-CDDP細(xì)胞的耐藥性及其分子機制,為其研究開發(fā)并作為腫瘤化療的耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供了實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：鹽酸千金藤堿 多藥耐藥 MDR1 P-gp Bcl-2 c-Jun/JNK 食管癌
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 縮寫詞及中英文對照8-14
• 前言14-20
• 1. 食管癌鱗狀細(xì)胞癌的研究現(xiàn)狀14-15
• 2. ESCC臨床治療策略15-16
• 3. 小分子化合物與腫瘤耐藥16-18
• 4. 千金藤堿與腫瘤多藥耐藥18-20
• 第一章 CEH和CDDP聯(lián)用抑制食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長20-32
• 1. 儀器與材料20-22
• 1.1 儀器與耗材20-21
• 1.2 主要試劑21-22
• 1.3 細(xì)胞株22
• 1.4 試劑配制22
• 2. 實驗方法22-24
• 2.1 細(xì)胞復(fù)蘇22-23
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)23
• 2.3 細(xì)胞凍存23
• 2.4 MTT法檢測CHE和CDDP單用及聯(lián)用對食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖抑制23-24
• 2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和耐藥指數(shù)( Resistance index, RI )測定24
• 2.6 CEH和CDDP聯(lián)合指數(shù)( Combination index, CI )測定24
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)分析24
• 3. 實驗結(jié)果24-30
• 3.1 Eca109及Eca109-CDDP細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及耐藥細(xì)胞株耐藥指數(shù)的測定24-26
• 3.2 CEH對正常細(xì)胞毒性26-27
• 3.3 CEH和CDDP抑制人食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長且聯(lián)用能顯著增加人食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對CDDP的敏感性27-30
• 4. 討論30-31
• 5. 本章小結(jié)31-32
• 第二章 CEH聯(lián)用CDDP誘導(dǎo)人食管鱗癌細(xì)胞凋亡32-45
• 1. 儀器與材料32-36
• 1.1 儀器與設(shè)備32
• 1.2 實驗材料32-33
• 1.3 實驗所用抗體33
• 1.4 實驗主要溶液配制方法33-36
• 1.4.1 WB相關(guān)試劑配制33-36
• 1.4.2 其他試劑配制36
• 2. 實驗方法36-39
• 2.1 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡36
• 2.2 WB法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)36-39
• 2.2.1 細(xì)胞總蛋白的提取36-37
• 2.2.2 測定細(xì)胞蛋白濃度37
• 2.2.3 SDS-PAGE電泳37
• 2.2.4 轉(zhuǎn)膜37-38
• 2.2.5 封閉38
• 2.2.6 一抗孵育38
• 2.2.7 二抗孵育38
• 2.2.8 辣根過氧化物酶ECL顯影38
• 2.2.9 灰度分析38-39
• 3. 實驗結(jié)果39-40
• 3.1 CEH與CDDP聯(lián)合促進(jìn)細(xì)胞凋亡39
• 3.2 CEH與CDDP聯(lián)合對細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響39-40
• 4. 討論40-41
• 5. 本章小結(jié)41-45
• 第三章 鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制45-54
• 1. 儀器與材料45-46
• 1.1 儀器與耗材45-46
• 1.2 實驗材料46
• 1.3 主要試劑配制46
• 1.3.1 RNA提取所用溶液配制46
• 2. 實驗方法46-48
• 2.1 細(xì)胞總RNA的提取46-47
• 2.2 反轉(zhuǎn)錄成c DNA47
• 2.3 Real-time PCR47-48
• 3. 實驗結(jié)果48-53
• 3.1 RT-PCR法檢測人食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中MDR1 m RNA隨CEH濃度變的化情況48-50
• 3.2 WB法檢測CEH在人食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中對P-gp的調(diào)節(jié)作用50-51
• 3.3 WB法檢測CEH在人食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中對Caspase 3 的調(diào)節(jié)作用51
• 3.4 WB法檢測CEH對JNK信號通路的影響51
• 3.5 WB法檢測CEH對其他信號通路的影響51-53
• 4. 討論53
• 5. 本章小結(jié)53-54
• 第四章 CEH和CDDP聯(lián)用體內(nèi)抗食管癌研究54-70
• 1. 儀器與材料54-55
• 1.1 儀器與耗材54
• 1.2 試劑和藥物54-55
• 1.3 藥物配制55
• 1.4 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境55
• 2. 實驗方法55-57
• 2.1 動物實驗55-56
• 2.2 H&E染色、免疫組化、免疫熒光56-57
• 3. 實驗結(jié)果57-60
• 3.1 CEH與CDDP聯(lián)用對裸鼠移植瘤的生長抑制及毒性作用57-59
• 3.2 CEH與CDDP聯(lián)用可以促進(jìn)裸鼠移植瘤內(nèi)細(xì)胞的凋亡59-60
• 3.3 CEH與CDDP聯(lián)用可以激活荷瘤小鼠體內(nèi)c-Jun/JNK信號通路，抑制P-gp的表達(dá)60
• 4. 討論60-61
• 5. 本章小結(jié)61-70
• 結(jié)論70-71
• 主要創(chuàng)新點71-72
• 展望72-73
• 參考文獻(xiàn)73-80
• 致謝80

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本文編號：500385