本文關(guān)鍵詞：PURA和RIP3與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是我國食管癌的主要病理類型。其易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物重要的細(xì)胞死亡方式之一,細(xì)胞凋亡受阻與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Caspase-8是半胱氨酸蛋白酶家族的一員,能在外源凋亡信號(hào)誘導(dǎo)下被募集形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(Death-inducing signaling complex, DISC),進(jìn)一步活化后啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。Caspase-8剪切異構(gòu)體Caspase-8L由于其缺乏C末端催化結(jié)構(gòu)域而保留了完整的N末端死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域,在Jurkat等細(xì)胞中能競(jìng)爭(zhēng)性與DISC結(jié)合而抑制細(xì)胞凋亡。富含嘌呤元件結(jié)合蛋白a (Purine-rich element binding protein alpha, PURa)通過直接或間接與DNA結(jié)合,調(diào)控細(xì)胞DNA損傷修復(fù)和多種腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)；通過與RNA結(jié)合而調(diào)控RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究建立了穩(wěn)定過表達(dá)PURα的食管癌細(xì)胞KYSE510-PURα和對(duì)照細(xì)胞KYSE 510-pCMV6,探討PURα過表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞Caspase-8/Caspase-8L等基因表達(dá)及其功能的影響。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PURα促進(jìn)Caspase-8 L的表達(dá)和胞漿定位,而抑制Caspase-8的活化。相反,抑制食管癌細(xì)胞PURa表達(dá)會(huì)促進(jìn)Caspase-8的活化。Caspase-8L的高表達(dá)和胞漿轉(zhuǎn)位抑制Caspase-8酶活性。侵襲和轉(zhuǎn)移是與食管癌預(yù)后差密切相關(guān)的原因,上皮間葉轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力的重要生物學(xué)特性。對(duì)食管癌細(xì)胞如何獲得EMT表型,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理知之甚少。通過對(duì)穩(wěn)定過表達(dá)PURα的食管癌細(xì)胞KYSE 510-PURa及其對(duì)照細(xì)胞KYSE510-pCMV6的轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)多種與細(xì)胞粘附相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄發(fā)生明顯改變。同時(shí),過表達(dá)PURα的食管癌細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)纖維樣改變。蛋白免疫印跡和細(xì)胞免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),過表達(dá)PURα的食管癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)減少,而N-cadherin、 Vimentin和Snail表達(dá)升高。細(xì)胞增殖速度加快,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與侵襲以及劃痕愈合能力顯著增加,呈現(xiàn)典型的EMT樣改變。同時(shí),在宮頸癌HeLa細(xì)胞中過表達(dá)PURα,也觀察到細(xì)胞發(fā)生同樣的EMT表型改變。進(jìn)一步,對(duì)181例食管癌和癌旁組織的免疫組化分析,結(jié)果表明食管癌組織中PURα表達(dá)顯著升高(p0.001)。PURα表達(dá)增高誘導(dǎo)ESCC等腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變,細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和侵襲遷移能力增強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞過表達(dá)PURα是導(dǎo)致食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因之一。順鉑是食管癌治療的主要化療藥物之一,能通過與DNA堿基發(fā)生交聯(lián),抑制腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制過程而引起腫瘤細(xì)胞死亡。受體相互作用蛋白激酶3 (Receptor interacting protein kinase 3, RIP3)在細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮重要的作用。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在食管癌KYSE 140細(xì)胞中穩(wěn)定敲降RIP3后,細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低。定量蛋白質(zhì)組分析提示RIP3通過DNA損傷修復(fù)通路影響食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。然而,RIP3影響細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的分子機(jī)制尚不十分清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在食管癌KYSE 140細(xì)胞中瞬時(shí)敲降RIP3,細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低。相反,在食管癌KYSE 140和KYSE510細(xì)胞,以及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryo fibroblast, MEF)過表達(dá)RIP3后,增加了細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。進(jìn)一步,通過成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)/CRISPR相關(guān)基因9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated gene 9, CRISPR/Cas9)技術(shù),在人胚腎HEK293T細(xì)胞中構(gòu)建了RIP3基因穩(wěn)定敲除細(xì)胞HEK293T-RIP3KO。進(jìn)而在RIP3缺失細(xì)胞中重新表達(dá)野生型或激酶結(jié)構(gòu)域突變RIP3后,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)野生型和激酶結(jié)構(gòu)域突變的RIP3均增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,而且這一功能不依賴于RIP3的激酶活性。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,在敲除RIP3的HEK293T-RIP3KO細(xì)胞中過表達(dá)RIP3后,細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路中CDC37、c-JUN、FOSL1、POLD1、和磷酸化JNK、ERK和AKT等關(guān)鍵分子的表達(dá)發(fā)生明顯改變。RIP3通過影響細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路而維持細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。推測(cè)RIP3可能參與DNA錯(cuò)配修復(fù)(Mismatch repair, MMR),通過介導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而維持生物體基因組穩(wěn)定性。DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷會(huì)使整個(gè)基因組不穩(wěn)定,最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。因此,RIP3有可能作為一種潛在的藥物靶標(biāo),影響腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑治療的敏感性。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗狀細(xì)胞癌 PURα Caspase-8 酶活性 上皮間葉轉(zhuǎn)化 RIP3 順鉑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1
【目錄】：

• 縮略語索引表8-10
• 摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 引言14-16
• 第一部分 PURα促進(jìn)食管癌細(xì)胞Caspase-8L的抗凋亡功能16-41
• 摘要16-17
• Abstract17-19
• 引言19-22
• 材料和方法22-32
• 一、材料22-25
• 1. 細(xì)胞系22
• 2. 菌株與質(zhì)粒22
• 3. 抗體22
• 4. 主要儀器22-23
• 5. 主要試劑23-24
• 6. 常用溶液的配制24-25
• 二、方法25-32
• 1. 細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 2. 細(xì)胞全蛋白提取26
• 3. Bradford法蛋白定量26
• 4. Western blot analysis26-27
• 5. 免疫熒光27-28
• 6. 質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取28-29
• 7. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系篩選29-30
• 8. Caspase-8蛋白酶活檢測(cè)30-32
• 結(jié)果32-36
• 1. PURα過表達(dá)食管癌細(xì)胞構(gòu)建32-33
• 1.1 PURα在不同食管癌細(xì)胞中的表達(dá)32
• 1.2 PURα過表達(dá)載體構(gòu)建32
• 1.3 PURα過表達(dá)細(xì)胞系篩選32-33
• 2. PURα過表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡33-36
• 2.1 PURα過表達(dá)上調(diào)食管癌細(xì)胞Caspase-8L表達(dá)33-34
• 2.2 PURα過表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞Caspase-8L胞漿轉(zhuǎn)位34
• 2.3 Caspase-8L胞漿定位抑制外源凋亡通路的活化和促進(jìn)細(xì)胞存活34-36
• 討論36-40
• 小結(jié)40-41
• 第二部分 PURα過表達(dá)引起食管癌細(xì)胞EMT41-70
• 摘要41-42
• Abstract42-43
• 前言43-44
• 材料和方法44-46
• 一、材料44
• 1. 抗體44
• 2. 試劑44
• 二、方法44-46
• 1. 免疫組織化學(xué)44-45
• 2. WST-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)45
• 3. 細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)45
• 4. 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和劃痕創(chuàng)傷愈合修復(fù)分析45-46
• 結(jié)果46-60
• 1. PURα在食管癌和癌旁食管上皮中的表達(dá)46-47
• 2. KYSE 510-PURα和KYSE 510-pCMV6細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析47-53
• 4. 過表達(dá)PURα的KYSE 510細(xì)胞形態(tài)的檢測(cè)53-55
• 5. 過表達(dá)PURα對(duì)KYSE 510細(xì)胞生長(zhǎng)影響55
• 6. E-cadherin和Vimentin在KYSE 510-PURα細(xì)胞中的表達(dá)55-56
• 7. EMT相關(guān)蛋白在PURα過表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá)56-58
• 8. KYSE 510-PURα細(xì)胞遷移能力的分析58
• 9. KYSE 510-PURα細(xì)胞侵襲能力的分析58-60
• 討論60-69
• 小結(jié)69-70
• 第三部分 RIP3過表達(dá)增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性70-92
• 摘要70-71
• Abstract71-72
• 前言72-73
• 材料和方法73-77
• 一、材料73-74
• 1. 細(xì)胞系73
• 2. 抗體73
• 3. 菌株與質(zhì)粒73
• 4. siRNA73-74
• 二、方法74-77
• 1. 細(xì)胞培養(yǎng)74
• 2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染74
• 3. WST-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率74-75
• 4. 順鉑處理細(xì)胞75
• 5. 在HEK293T細(xì)胞RIP3基因的CRISPR/Cas9穩(wěn)定敲除75-77
• 結(jié)果77-82
• 1. KYSE 140細(xì)胞敲降RIP3對(duì)順鉑敏感性的影響77
• 2. KYSE 140細(xì)胞過表達(dá)RIP3對(duì)順鉑敏感性的影響77-78
• 3. KYSE 510細(xì)胞過表達(dá)RIP3對(duì)順鉑敏感性的影響78
• 4. MEF細(xì)胞過表達(dá)RIP3對(duì)順鉑敏感性的影響78-79
• 5. HEK293T細(xì)胞敲除RIP3基因79-80
• 6. HEK293T-RIP3KO細(xì)胞過表達(dá)RIP3對(duì)順鉑敏感性的影響80
• 7. 過表達(dá)RIP3對(duì)HEK293T-RIP3KO細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路影響80-82
• 討論82-91
• 小結(jié)91-92
• 參考文獻(xiàn)92-99
• 文獻(xiàn)綜述99-112
• 參考文獻(xiàn)109-112
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷112-114
• 致謝114-115
• 附件：研究生期間獲獎(jiǎng)證書和發(fā)表文章115-137

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1 郭志敏;PURA和RIP3與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

  本文關(guān)鍵詞：PURA和RIP3與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：498593