本文關鍵詞：靶向間皮素的嵌合抗原受體修飾T細胞（mesoCAR-T）治療肝癌的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：癌癥現(xiàn)在已成為人類健康的頭號殺手,世界范圍內(nèi),肝癌發(fā)病率在所有癌癥中居第六位,每年約有750萬新增病例,死亡率高居第三位�？焖俚纳罟�(jié)奏、巨大的工作壓力、不健康的飲食習慣、糟糕的環(huán)境都是癌癥發(fā)生的幫兇,使得癌癥的高發(fā)率和年輕化趨勢也越來越明顯。早期肝癌進行有效治療后五年生存率能達到50% 70%。但是由于肝癌早期診斷技術(shù)的限制,肝癌總的五年生存率只有10%。目前常用的治療手段主要包括手術(shù)切除、肝臟移植、化療、化療栓塞、射頻消融、質(zhì)子射線療法等,但效果十分有限。因此,仍需探索一個更加有效的治療方法,來提高肝癌生存率和生存質(zhì)量。近年來免疫療法的興起,即利用自身免疫系統(tǒng)來抵御癌癥,給癌癥患者帶來了新的希望。然而,癌癥患者自身的免疫系統(tǒng)受損嚴重,狡猾的腫瘤細胞又會通過MHC分子的低表達或不表達來逃脫免疫細胞的攻擊,這些都給治療帶來了很大困難。因此,精密制導、精準打擊的免疫細胞武器—CAR-T技術(shù)應運而生。CAR-T細胞,即嵌合型抗原受體修飾的T細胞,這種通過基因修飾T細胞的過繼性免疫細胞療法,可以克服MHC介導的免疫逃逸機制,快速建立腫瘤免疫并消除小型或大型腫瘤負擔,被認為是一種很有前景的治療策略。尤其是靶向CD19的CAR-T細胞在惡性血液病中取得的巨大成功,開創(chuàng)了腫瘤生物治療的新紀元。CAR-T技術(shù)雖在惡性血液病中獲得驚人效果,運用到實體瘤時卻處處碰壁,除了實體瘤更加復雜的腫瘤抑制微環(huán)境外,還面臨著很多問題:缺乏類似于CD19這樣特異的靶點,轉(zhuǎn)染效率不高,CAR的數(shù)量和CAR的親和力等。本文構(gòu)建并檢測了針對間皮素的第二代CAR T細胞對幾種肝癌細胞株的體外殺傷作用:(1)構(gòu)建包含CD3ζ和4-1BB兩個胞內(nèi)共刺激區(qū)的mesoCAR,通過piggy Bac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)染T細胞,獲得mesoCAR-T細胞。替代常用的慢病毒載體轉(zhuǎn)染方式,其陽性率可達到66%。流式檢測K562-meso刺激下mesoCAR-T的活化表型(CD137,CD28,CD27,CD134,CD38,CD107α),結(jié)果顯示mesoCAR-T細胞可被K562-meso細胞激活。(2)通過RT-PCR、Western Blot檢測多種腫瘤細胞株間皮素的表達水平,并人工構(gòu)建間皮素高表達細胞株。篩選出了四種不同表達水平的肝癌細胞株,檢測mesoCAR-T細胞對高表達(SMMC-7721、BEL-7404)及低表達細胞株(Hep G2、Huh7)的殺傷作用差異。結(jié)果顯示mesoCAR-T細胞對間皮素高表達細胞株的殺傷作用明顯強于低表達或不表達間皮素的細胞株,表明構(gòu)建的mesoCAR-T細胞具有一定的特異性。(3)通過檢測mesoCAR-T細胞的細胞因子發(fā)現(xiàn),IFN-γ、TNF-α、、IL2的分泌明顯高于對照組T細胞。mesoCAR-T與腫瘤細胞共培養(yǎng)IFN-γ的分泌量與腫瘤細胞株間皮素的表達量也基本成正比關系。(4)SMMC-7721小鼠移植瘤模型中,與PBS和control T細胞組相比,mesoCART細胞治療組對腫瘤的抑制作用更強,且能在體內(nèi)更好地增殖。本文構(gòu)建的mesoCAR-T細胞,在轉(zhuǎn)染效率、免疫細胞因子的分泌、體內(nèi)外殺傷方面都表現(xiàn)出較好的效果,為其在臨床上的應用奠定了基礎。
【關鍵詞】：CAR 間皮素 免疫療法 piggyBac 肝癌
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-13
• 第一章 嵌合型抗原受體T細胞（CAR-T）概念及研究進展13-21
• 1.1 嵌合型抗原受體T細胞的概念13-15
• 1.2 T細胞的抗腫瘤機制15-16
• 1.3 CAR-T療法的研究進展16-17
• 1.4 間皮素作為腫瘤治療靶點的研究進展17-19
• 1.4.1 間皮素的發(fā)現(xiàn)及特征17-18
• 1.4.2 以間皮素為靶點的探索18
• 1.4.3 間皮素CAR-T的研究進展18-19
• 1.4.4 間皮素CAR-T細胞的脫靶毒性19
• 1.5 PB轉(zhuǎn)座子19-20
• 1.6 本課題的研究內(nèi)容20-21
• 第二章 靶向間皮素的嵌合型抗原受體修飾的T細胞（mesoCAR-T）構(gòu)建21-33
• 2.1 實驗器材21-23
• 2.1.1 實驗儀器21
• 2.1.2 實驗材料21
• 2.1.3 引物設計21-22
• 2.1.4 實驗試劑22
• 2.1.5 實驗試劑的配制22-23
• 2.2 實驗方法23-28
• 2.2.1 大量抽提載體質(zhì)粒PNBS328、pGH-mesoCAR23-24
• 2.2.2 酶切、連接、轉(zhuǎn)化24-25
• 2.2.3 小量抽提質(zhì)粒、酶切鑒定25-26
• 2.2.4 電轉(zhuǎn)染獲得mesoCAR-T細胞26
• 2.2.5 檢測T細胞中mesoCAR的表達26-28
• 2.3 實驗結(jié)果28-32
• 2.3.1 mesoCAR基因結(jié)構(gòu)示意圖28-29
• 2.3.2 PNBS328-mesoCAR質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果29-30
• 2.3.3 T細胞形態(tài)30
• 2.3.4 轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果30-32
• 2.4 結(jié)果分析與討論32-33
• 第三章 間皮素高表達肝癌細胞株的篩選和人工構(gòu)建33-41
• 3.1 實驗器材33-34
• 3.1.1 實驗儀器33
• 3.1.2 引物設計33
• 3.1.3 實驗試劑33
• 3.1.4 實驗試劑的配置33-34
• 3.2 實驗方法34-38
• 3.2.1 各腫瘤細胞系的復蘇及培養(yǎng)34-35
• 3.2.2 RT-PCR檢測各細胞系中間皮素的表達35-36
• 3.2.3 Western Bolt檢測各細胞系中間皮素的表達36
• 3.2.4 構(gòu)建間皮素高表達細胞株─293-meso36-38
• 3.3 實驗結(jié)果38-39
• 3.3.1 各腫瘤細胞株間皮素抗原的RT-PCR結(jié)果38
• 3.3.2 各腫瘤細胞株間皮素抗原的WB檢測結(jié)果38-39
• 3.3.3 構(gòu)建的 293-meso細胞39
• 3.4 結(jié)果分析與討論39-41
• 第四章 mesoCAR-T細胞的功能分析41-51
• 4.1 實驗器材41
• 4.1.1 實驗儀器41
• 4.1.2 實驗材料41
• 4.2 實驗方法41-43
• 4.2.1 流式檢測mesoCAR-T細胞表型41
• 4.2.2 流式檢測mesoCAR-T細胞胞內(nèi)細胞因子41-42
• 4.2.3 檢測mesoCAR-T細胞的體外殺傷能力42
• 4.2.4 LDH法檢測CAR-T細胞的殺傷能力42-43
• 4.2.5 Elisa檢測共培養(yǎng)條件下CAR-T細胞IFN-γ的分泌43
• 4.3 實驗結(jié)果43-50
• 4.3.1 抗原刺激下mesoCAR-T細胞表型43-45
• 4.3.2 實時監(jiān)測系統(tǒng)檢測mesoCAR-T對腫瘤細胞株的殺傷作用45-47
• 4.3.3 LDH法檢測mesoCAR-T細胞對K562-meso的殺傷47-48
• 4.3.4 RTCA檢測mesoCAR-T細胞對239和 293-meso的殺傷48
• 4.3.5 檢測mesoCAR-T細胞因子的流式結(jié)果48-49
• 4.3.6 mesoCAR-T細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)IFN-γ的分泌49-50
• 4.4 結(jié)果分析與討論50-51
• 第五章 SMMC-7721 小鼠移植瘤模型實驗51-53
• 5.1 實驗材料51
• 5.2 實驗方法51
• 5.3 實驗結(jié)果51-52
• 5.4 結(jié)果分析與討論52-53
• 討論53-55
• 參考文獻55-63
• 致謝63

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