本文關(guān)鍵詞：靶向間皮素的嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞（mesoCAR-T）治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：癌癥現(xiàn)在已成為人類健康的頭號(hào)殺手,世界范圍內(nèi),肝癌發(fā)病率在所有癌癥中居第六位,每年約有750萬新增病例,死亡率高居第三位�？焖俚纳罟�(jié)奏、巨大的工作壓力、不健康的飲食習(xí)慣、糟糕的環(huán)境都是癌癥發(fā)生的幫兇,使得癌癥的高發(fā)率和年輕化趨勢也越來越明顯。早期肝癌進(jìn)行有效治療后五年生存率能達(dá)到50% 70%。但是由于肝癌早期診斷技術(shù)的限制,肝癌總的五年生存率只有10%。目前常用的治療手段主要包括手術(shù)切除、肝臟移植、化療、化療栓塞、射頻消融、質(zhì)子射線療法等,但效果十分有限。因此,仍需探索一個(gè)更加有效的治療方法,來提高肝癌生存率和生存質(zhì)量。近年來免疫療法的興起,即利用自身免疫系統(tǒng)來抵御癌癥,給癌癥患者帶來了新的希望。然而,癌癥患者自身的免疫系統(tǒng)受損嚴(yán)重,狡猾的腫瘤細(xì)胞又會(huì)通過MHC分子的低表達(dá)或不表達(dá)來逃脫免疫細(xì)胞的攻擊,這些都給治療帶來了很大困難。因此,精密制導(dǎo)、精準(zhǔn)打擊的免疫細(xì)胞武器—CAR-T技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。CAR-T細(xì)胞,即嵌合型抗原受體修飾的T細(xì)胞,這種通過基因修飾T細(xì)胞的過繼性免疫細(xì)胞療法,可以克服MHC介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制,快速建立腫瘤免疫并消除小型或大型腫瘤負(fù)擔(dān),被認(rèn)為是一種很有前景的治療策略。尤其是靶向CD19的CAR-T細(xì)胞在惡性血液病中取得的巨大成功,開創(chuàng)了腫瘤生物治療的新紀(jì)元。CAR-T技術(shù)雖在惡性血液病中獲得驚人效果,運(yùn)用到實(shí)體瘤時(shí)卻處處碰壁,除了實(shí)體瘤更加復(fù)雜的腫瘤抑制微環(huán)境外,還面臨著很多問題:缺乏類似于CD19這樣特異的靶點(diǎn),轉(zhuǎn)染效率不高,CAR的數(shù)量和CAR的親和力等。本文構(gòu)建并檢測了針對(duì)間皮素的第二代CAR T細(xì)胞對(duì)幾種肝癌細(xì)胞株的體外殺傷作用:(1)構(gòu)建包含CD3ζ和4-1BB兩個(gè)胞內(nèi)共刺激區(qū)的mesoCAR,通過piggy Bac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞,獲得mesoCAR-T細(xì)胞。替代常用的慢病毒載體轉(zhuǎn)染方式,其陽性率可達(dá)到66%。流式檢測K562-meso刺激下mesoCAR-T的活化表型(CD137,CD28,CD27,CD134,CD38,CD107α),結(jié)果顯示mesoCAR-T細(xì)胞可被K562-meso細(xì)胞激活。(2)通過RT-PCR、Western Blot檢測多種腫瘤細(xì)胞株間皮素的表達(dá)水平,并人工構(gòu)建間皮素高表達(dá)細(xì)胞株。篩選出了四種不同表達(dá)水平的肝癌細(xì)胞株,檢測mesoCAR-T細(xì)胞對(duì)高表達(dá)(SMMC-7721、BEL-7404)及低表達(dá)細(xì)胞株(Hep G2、Huh7)的殺傷作用差異。結(jié)果顯示mesoCAR-T細(xì)胞對(duì)間皮素高表達(dá)細(xì)胞株的殺傷作用明顯強(qiáng)于低表達(dá)或不表達(dá)間皮素的細(xì)胞株,表明構(gòu)建的mesoCAR-T細(xì)胞具有一定的特異性。(3)通過檢測mesoCAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn),IFN-γ、TNF-α、、IL2的分泌明顯高于對(duì)照組T細(xì)胞。mesoCAR-T與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)IFN-γ的分泌量與腫瘤細(xì)胞株間皮素的表達(dá)量也基本成正比關(guān)系。(4)SMMC-7721小鼠移植瘤模型中,與PBS和control T細(xì)胞組相比,mesoCART細(xì)胞治療組對(duì)腫瘤的抑制作用更強(qiáng),且能在體內(nèi)更好地增殖。本文構(gòu)建的mesoCAR-T細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染效率、免疫細(xì)胞因子的分泌、體內(nèi)外殺傷方面都表現(xiàn)出較好的效果,為其在臨床上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：CAR 間皮素 免疫療法 piggyBac 肝癌
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-13
• 第一章 嵌合型抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）概念及研究進(jìn)展13-21
• 1.1 嵌合型抗原受體T細(xì)胞的概念13-15
• 1.2 T細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制15-16
• 1.3 CAR-T療法的研究進(jìn)展16-17
• 1.4 間皮素作為腫瘤治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展17-19
• 1.4.1 間皮素的發(fā)現(xiàn)及特征17-18
• 1.4.2 以間皮素為靶點(diǎn)的探索18
• 1.4.3 間皮素CAR-T的研究進(jìn)展18-19
• 1.4.4 間皮素CAR-T細(xì)胞的脫靶毒性19
• 1.5 PB轉(zhuǎn)座子19-20
• 1.6 本課題的研究內(nèi)容20-21
• 第二章 靶向間皮素的嵌合型抗原受體修飾的T細(xì)胞（mesoCAR-T）構(gòu)建21-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)器材21-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料21
• 2.1.3 引物設(shè)計(jì)21-22
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑22
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑的配制22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-28
• 2.2.1 大量抽提載體質(zhì)粒PNBS328、pGH-mesoCAR23-24
• 2.2.2 酶切、連接、轉(zhuǎn)化24-25
• 2.2.3 小量抽提質(zhì)粒、酶切鑒定25-26
• 2.2.4 電轉(zhuǎn)染獲得mesoCAR-T細(xì)胞26
• 2.2.5 檢測T細(xì)胞中mesoCAR的表達(dá)26-28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-32
• 2.3.1 mesoCAR基因結(jié)構(gòu)示意圖28-29
• 2.3.2 PNBS328-mesoCAR質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果29-30
• 2.3.3 T細(xì)胞形態(tài)30
• 2.3.4 轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果30-32
• 2.4 結(jié)果分析與討論32-33
• 第三章 間皮素高表達(dá)肝癌細(xì)胞株的篩選和人工構(gòu)建33-41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)器材33-34
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器33
• 3.1.2 引物設(shè)計(jì)33
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑33
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑的配置33-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-38
• 3.2.1 各腫瘤細(xì)胞系的復(fù)蘇及培養(yǎng)34-35
• 3.2.2 RT-PCR檢測各細(xì)胞系中間皮素的表達(dá)35-36
• 3.2.3 Western Bolt檢測各細(xì)胞系中間皮素的表達(dá)36
• 3.2.4 構(gòu)建間皮素高表達(dá)細(xì)胞株─293-meso36-38
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-39
• 3.3.1 各腫瘤細(xì)胞株間皮素抗原的RT-PCR結(jié)果38
• 3.3.2 各腫瘤細(xì)胞株間皮素抗原的WB檢測結(jié)果38-39
• 3.3.3 構(gòu)建的 293-meso細(xì)胞39
• 3.4 結(jié)果分析與討論39-41
• 第四章 mesoCAR-T細(xì)胞的功能分析41-51
• 4.1 實(shí)驗(yàn)器材41
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器41
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)材料41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法41-43
• 4.2.1 流式檢測mesoCAR-T細(xì)胞表型41
• 4.2.2 流式檢測mesoCAR-T細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子41-42
• 4.2.3 檢測mesoCAR-T細(xì)胞的體外殺傷能力42
• 4.2.4 LDH法檢測CAR-T細(xì)胞的殺傷能力42-43
• 4.2.5 Elisa檢測共培養(yǎng)條件下CAR-T細(xì)胞IFN-γ的分泌43
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-50
• 4.3.1 抗原刺激下mesoCAR-T細(xì)胞表型43-45
• 4.3.2 實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)檢測mesoCAR-T對(duì)腫瘤細(xì)胞株的殺傷作用45-47
• 4.3.3 LDH法檢測mesoCAR-T細(xì)胞對(duì)K562-meso的殺傷47-48
• 4.3.4 RTCA檢測mesoCAR-T細(xì)胞對(duì)239和 293-meso的殺傷48
• 4.3.5 檢測mesoCAR-T細(xì)胞因子的流式結(jié)果48-49
• 4.3.6 mesoCAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)IFN-γ的分泌49-50
• 4.4 結(jié)果分析與討論50-51
• 第五章 SMMC-7721 小鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)51-53
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料51
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法51
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-52
• 5.4 結(jié)果分析與討論52-53
• 討論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 致謝63

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8 張e，

本文編號(hào)：498314