本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用新型斷接式發(fā)夾探針技術(shù)檢測(cè)CYP2C8基因SNP的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的:乳腺癌的聯(lián)合化療是該病治療的主要方法之一,其對(duì)患者預(yù)后有顯著的改善作用,但化療的藥效和毒副作用在不同個(gè)體的差異顯著,研究表明這與單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)關(guān)系密切,但相關(guān)的多基因SNP與療效之間的精確關(guān)聯(lián),目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。發(fā)夾探針是一類適用于SNP等單個(gè)堿基突變檢測(cè)的重要工具,將發(fā)夾探針固定在載體表面可進(jìn)行多位點(diǎn)SNP檢測(cè),但是作為發(fā)夾探針技術(shù)優(yōu)勢(shì)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)現(xiàn)象因在實(shí)際應(yīng)用中難以保留而使發(fā)夾探針的應(yīng)用受到較大的制約。為了解決這一問題,國(guó)內(nèi)外的主要改進(jìn)方法都是采用探針莖臂修飾的方式,但這種方式的技術(shù)難度較大,且運(yùn)用也受到一定的限制。為此,在本研究中,我們綜合各種改良設(shè)計(jì)的利弊,提出了新型斷端對(duì)接式發(fā)夾探針技術(shù),以熒光素/淬滅素?cái)喽藢?duì)接/緊密接觸的方式,使探針原始核心技術(shù)-FRET現(xiàn)象以不同的方式實(shí)現(xiàn);并結(jié)合納米磁珠的強(qiáng)大熒光信號(hào)富集放大效應(yīng),建立基于斷接式發(fā)夾型探針結(jié)合磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng),該技術(shù)使該探針的檢測(cè)效果更加優(yōu)化。方法:1.通過NCBI Gen Bank查得乳腺癌治療常用的聯(lián)合化療藥物紫杉醇、阿霉素在肝內(nèi)代謝的重要相關(guān)基因CYP2C8的序列,以該基因的原始序列和139A/G位點(diǎn)SNP突變序列分別作為后續(xù)試驗(yàn)用的原始靶序列和突變靶序列,并運(yùn)用生物信息學(xué)軟件根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)用于檢測(cè)CYP2C8基因SNP突變的斷接式發(fā)夾探針。通過探針比例和雜交溫度摸索,最終確定檢測(cè)體系的最適探針濃度比和最適溫度,來區(qū)分靶序列和突變靶序列。2.將上述獲得的斷接式發(fā)夾型DNA探針與納米磁珠進(jìn)行固定,建立斷接式發(fā)夾探針納米磁珠信號(hào)放大系統(tǒng),并將固定斷接式發(fā)夾型DNA探針的納米磁珠收集在離心管中,進(jìn)行納米磁珠熒光信號(hào)富集的信號(hào)放大效果檢測(cè),同時(shí)選取探針進(jìn)行標(biāo)記修飾,對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行條件優(yōu)化,并在熒光顯微鏡下觀察和比較靶序列和突變序列的熒光,摸索集合磁珠檢測(cè)體系的最佳濃度和溫度以及時(shí)間。3.收集50例乳腺癌患者的血液標(biāo)本,提取這些患者的全血基因組DNA,設(shè)計(jì)并合成CYP2C8基因139A/G SNP位點(diǎn)突變檢測(cè)引物,進(jìn)行人CYP2C8基因的PCR擴(kuò)增,并對(duì)CYP2C8基因片段進(jìn)行切膠回收;利用已經(jīng)成功建立的斷接式發(fā)夾型探針結(jié)合磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,明確新構(gòu)建方法臨床檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性,并對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果:1.CYP2C8基因序列第139個(gè)編碼氨基酸的堿基序列為AGG,發(fā)生SNP突變后為AAG。經(jīng)探針設(shè)計(jì)和條件摸索,CYP2C8的139A/G SNP檢測(cè)體系的最適雜交溫度為40℃,最佳探針比例為熒光探針P1:淬滅探針P2為1:4,最佳雜交時(shí)間固定磁珠為2h,經(jīng)過優(yōu)化的CYP2C8 SNP檢測(cè)體系對(duì)139A/G的突變檢測(cè)效果顯著。2.成功構(gòu)建了以斷接式發(fā)夾型DNA探針為識(shí)別分子并固定的納米磁珠,且富集納米磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng)的檢測(cè)效果顯著,能夠更高效、更靈敏地區(qū)分CYP2C8基因的SNP位點(diǎn)原始序列和突變序列的熒光信號(hào)強(qiáng)度,提示斷接式發(fā)夾型探針結(jié)合磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng)初步構(gòu)建成功。3.提取乳腺癌患者DNA濃度較高,CYP2C8基因139A/G SNP位點(diǎn)突變序列擴(kuò)增效果良好,所得片段與設(shè)計(jì)引物時(shí)預(yù)期片段大小(153bp左右)一致。斷接式發(fā)夾型探針結(jié)合磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng)對(duì)CYP2C8基因139A/G SNP位點(diǎn)突變的檢測(cè)效果確切。結(jié)論:1.本研究成功建立了運(yùn)用斷接式發(fā)夾型DNA探針檢測(cè)SNP位點(diǎn)的新反應(yīng)體系,該體系可以對(duì)乳腺癌化療藥物代謝相關(guān)的CYP2C8基因第139個(gè)編碼氨基酸位置的SNP位點(diǎn)突變進(jìn)行高效的檢測(cè)。2.在發(fā)夾探針的基礎(chǔ)上,本研究初步建立了斷接式發(fā)夾型探針結(jié)合磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng),其對(duì)CYP2C8基因139A/G SNP位點(diǎn)突變的檢測(cè)效果顯著,是一種簡(jiǎn)單、高效地檢出SNP位點(diǎn)的新方法,可能為臨床藥物的個(gè)體化應(yīng)用和新藥靶點(diǎn)研究等提供重要的檢測(cè)手段。
【關(guān)鍵詞】：CYP2C8基因 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism SNP) 斷接式發(fā)夾型DNA探針 分子信標(biāo) 納米磁珠
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9;R730.43
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• Abstract5-8
• 摘要8-10
• 第一章 前言10-13
• 第二章 CYP2C8基因 139A/G斷接式發(fā)夾型DNA探針設(shè)計(jì)及驗(yàn)證13-27
• 2.1 試劑及配制14-16
• 2.2 結(jié)果16-23
• 2.3 討論23-26
• 2.4 小結(jié)26-27
• 第三章 基于斷接式發(fā)夾探針技術(shù)的納米磁珠信號(hào)放大檢測(cè)系統(tǒng)的初步構(gòu)建27-40
• 3.1 材料與方法28-31
• 3.2 結(jié)果31-37
• 3.3 討論37-39
• 3.4 小結(jié)39-40
• 第四章 基于斷接式發(fā)夾型DNA探針技術(shù)的初步應(yīng)用40-50
• 4.1 材料與方法40-44
• 4.2 結(jié)果44-47
• 4.3 討論47-48
• 4.4 小結(jié)48-50
• 全文結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 文獻(xiàn)綜述57-65
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文65-66
• 致謝66

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 何云燕,何云燕,王升啟,陳蘇紅,陳忠斌,王小紅,管偉;復(fù)合探針PCR定量檢測(cè)HBV方法的建立及臨床應(yīng)用[J];中華肝臟病雜志;2001年06期

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3 李改茹,晉衛(wèi)軍;金屬鈀/鉑卟啉室溫q泄馓秸朐諫鏌窖Я煊虻撓τ醚芯縖J];分析化學(xué);2002年12期

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本文編號(hào)：493179