本文關(guān)鍵詞：利用定向蛋白組學(xué)液質(zhì)串聯(lián)技術(shù)對(duì)乳腺癌耐藥相關(guān)膜蛋白的定量分析研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:乳腺癌化療過(guò)程中多藥耐藥性的高發(fā)和膜蛋白相關(guān),其中包括P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptor,Tf R)。有研究表明P-gp蛋白能夠?qū)⒒熕幬飶娜橄侔┠[瘤細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外,它的過(guò)度表達(dá)與腫瘤多藥耐藥相關(guān)。Tf R蛋白參與鐵的吸收并在細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖方面發(fā)揮作用,已有很多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)Tf R蛋白在許多種癌癥包括乳腺癌中過(guò)度表達(dá)并且耐藥細(xì)胞和產(chǎn)生耐藥的乳腺癌組織中表達(dá)量更多。準(zhǔn)確定量測(cè)定乳腺癌中P-gp蛋白和Tf R蛋白的含量將有助于改善腫瘤的早期檢測(cè)診斷和預(yù)測(cè)乳腺癌患者的化療效果及預(yù)后評(píng)估。方法:利用基于LC-MS/MS的定向蛋白組學(xué)液質(zhì)串聯(lián)技術(shù)建立對(duì)P-gp蛋白和Tf R蛋白定量檢測(cè)的方法,用于測(cè)定乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中P-gp蛋白和Tf R蛋白的含量。結(jié)果:1.434STTVQLMQR442,674GSQAQDR680和368IIDNKPSIDSYSK380這三個(gè)肽段是P-gp蛋白胰蛋白酶水解的特異性肽段,選取434STTVQLMQR442代替P-gp蛋白作為研究目標(biāo)物進(jìn)行定量,建立P-gp蛋白定量檢測(cè)MRM條件,采用內(nèi)標(biāo)法用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽段STTV*QLMQR為內(nèi)標(biāo)物并準(zhǔn)確測(cè)定了乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/WT和乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR中P-gp蛋白的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,包括激光共聚焦技術(shù)、蛋白免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)。最后,利用建立的定量方法對(duì)60對(duì)產(chǎn)生化療藥物耐受的乳腺癌病人的癌組織和癌旁組織中的P-gp蛋白含量進(jìn)行了定量檢測(cè)。2.選取681VEYHFLSPYVSPK693代替Tf R蛋白本身作為研究目標(biāo)物進(jìn)行定量,建立Tf R蛋白定量檢測(cè)MRM條件,采用內(nèi)標(biāo)法用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽段V*EYHFLSPYVSPK為內(nèi)標(biāo)物。質(zhì)量控制數(shù)據(jù)結(jié)果顯示可接受的準(zhǔn)確度和精密度范圍,最后利用建立的方法準(zhǔn)確測(cè)定了三個(gè)乳腺癌細(xì)胞系和36對(duì)乳腺癌病人的癌組織和癌旁組織中Tf R蛋白的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與激光共聚焦技術(shù)、蛋白免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)和組織免疫化學(xué)方法所得結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)論:基于定向蛋白組學(xué)的液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能準(zhǔn)確定量細(xì)胞和臨床組織樣本中的P-gp蛋白和Tf R蛋白,并能應(yīng)用于低濃度的臨床樣本的測(cè)定。這種方法為將來(lái)大規(guī)模測(cè)定大分子生物標(biāo)志物提供了一種可能�？偠灾�,液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜分析手段具有快速經(jīng)濟(jì)、定量限低、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),尤其是在測(cè)定低濃度以及生物樣本時(shí)更能得到較為可靠的數(shù)據(jù)。實(shí)踐證明,液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能夠作為一種有效的定量分析手段應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 P-糖蛋白 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜法 定向蛋白組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-14
• 1 實(shí)驗(yàn)材料14-17
• 1.1 細(xì)胞株14
• 1.2 乳腺癌組織14
• 1.3 主要試劑14-16
• 1.4 主要儀器16-17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-28
• 2.1 樣品溶液配制17-18
• 2.1.1 P-gp貯備液、標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制17
• 2.1.2 TfR貯備液、標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制17-18
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和組織收集18-19
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)18
• 2.2.2 組織收集18-19
• 2.3 膜蛋白提取19-20
• 2.3.1 細(xì)胞膜蛋白提取19
• 2.3.2 組織膜蛋白提取19-20
• 2.4 基質(zhì)溶液的制備20
• 2.5 溶液內(nèi)胰蛋白酶水解反應(yīng)及SPE富集純化20-21
• 2.6 SDS-PAGE和膠內(nèi)胰蛋白酶水解反應(yīng)及SPE富集純化21
• 2.7 質(zhì)譜條件21-22
• 2.7.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)21
• 2.7.2 飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)21-22
• 2.8 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽段內(nèi)標(biāo)物22
• 2.8.1 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的P-gp肽段內(nèi)標(biāo)物22
• 2.8.2 穩(wěn)定同位素標(biāo)記的TfR肽段內(nèi)標(biāo)物22
• 2.9 方法學(xué)驗(yàn)證22-23
• 2.10 常規(guī)的免疫學(xué)方法23-28
• 2.10.1 蛋白免疫印跡(western blotting)23-24
• 2.10.2 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)24-27
• 2.10.3 激光共聚焦(confocal microscopy)27
• 2.10.4 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)27-28
• 3 結(jié)果與討論28-55
• 3.1 利用基于LC-MS/MS的定向蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)P-gp的研究28-43
• 3.1.1 細(xì)胞和組織的P-gp的提取28-29
• 3.1.2 P-gp胰蛋白酶水解特異性肽段在LC-MS/MS上的響應(yīng)29-31
• 3.1.3 胰蛋白酶水解效率的考察31-32
• 3.1.4 P-gp的LC-MS/MS方法的建立及驗(yàn)證32-36
• 3.1.5 乳腺癌細(xì)胞中P-gp含量測(cè)定36-39
• 3.1.6 乳腺癌組織中P-gp含量測(cè)定39-43
• 3.2 利用基于LC-MS/MS的定向蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)TfR的研究43-55
• 3.2.1 細(xì)胞和組織的TfR的提取43-44
• 3.2.2 TfR胰蛋白酶水解特異性肽段在LC-MS/MS上的響應(yīng)44-46
• 3.2.3 胰蛋白酶水解效率的考察46-47
• 3.2.4 TfR的LC-MS/MS方法的建立及驗(yàn)證47-50
• 3.2.5 乳腺癌細(xì)胞中TfR含量測(cè)定50-51
• 3.2.6 乳腺癌組織中TfR含量測(cè)定51-55
• 4 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 綜述63-71
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 碩士研究生期間發(fā)表文章情況71-72
• 致謝72-73

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本文編號(hào)：492908