發(fā)布時(shí)間：2017-06-26 19:11

  本文關(guān)鍵詞：EZH2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的:神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)是兒童最常見的顱外實(shí)體瘤,目前國內(nèi)對(duì)早期、低危NB已取得較好的治療效果,但晚期NB,雖然結(jié)合運(yùn)用了手術(shù)、大劑量化療、放療及自體干細(xì)胞移植等手段,患兒五年生存率仍維持在50%左右,單純地加大手術(shù)、放化療強(qiáng)度已經(jīng)很難有效提高患兒的治療效果,未來的治療方向應(yīng)該是更加特異性、敏感性的治療手段—分子靶向治療。因此,尋求新而有效的潛在NB分子靶點(diǎn)具有重要意義。EZH2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)蛋白是多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repressor complex 2,PRC2)的核心催化元件,通過促使組蛋白H3甲基化對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。研究顯示,EZH2高表達(dá)是多種癌病預(yù)后不良的因素,在NB中,同樣發(fā)現(xiàn)EZH2在表觀遺傳上沉默NB抑癌基因CASZ1、CLU、RUNX3和NGFR,提示EZH2可做為NB分子靶向的潛位點(diǎn)。本課題的研究目的在于檢測(cè)EZH2蛋白在NB組織水平中的表達(dá)情況,并結(jié)合臨床資料分析其表達(dá)水平與NB患兒臨床病理因素和生存預(yù)后的關(guān)系,然后在NB細(xì)胞系中穩(wěn)定過表達(dá)和降表達(dá)EZH2,進(jìn)一步研究EZH2對(duì)NB發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。研究方法和主要結(jié)果:1.EZH2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中的蛋白表達(dá)情況方法:利用免疫組化的方法檢測(cè)74例NB組織中EZH2的表達(dá)情況。結(jié)果:74例患兒中陰性表達(dá)EZH2 2例,弱陽性表達(dá)EZH2 21例,陽性表達(dá)EZH231例,強(qiáng)陽性表達(dá)EZH2 20例,即EZH2弱表達(dá)23例,強(qiáng)表達(dá)51例。2.EZH2表達(dá)與NB患兒臨床病理特點(diǎn)及生存預(yù)后分析方法:利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析EZH2表達(dá)情況與NB患兒臨床病理因素之間和患兒生存預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果:經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,EZH2強(qiáng)表達(dá)與患兒腫瘤高分期(X2=6.931,P=0.008)、腫瘤伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(X2=5.722,P=0.017)及Ki67強(qiáng)表達(dá)(X2=29.827,P=0.000)正相關(guān),與短期治療效果達(dá)VGPR以上呈一定的負(fù)相關(guān),P值接近0.05(X2=4.045,P=0.052)。分析EZH2表達(dá)與患兒治療后復(fù)發(fā)情況提示,EZH2強(qiáng)表達(dá)與患兒復(fù)發(fā)存在一定的相關(guān)性,但P值大于0.05(X2=2.699,P=0.100)。而EZH2表達(dá)情況與患兒年齡、性別、原發(fā)部位及病理類型未見明顯相關(guān)性(P0.05)。3.構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)和降表達(dá)EZH2的NB細(xì)胞系,并分析其對(duì)NB細(xì)胞生物學(xué)行為的影響方法:通過構(gòu)建過表達(dá)EZH2和小RNA干擾下調(diào)EZH2的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的方法,建立穩(wěn)定過表達(dá)和降表達(dá)EZH2的NB細(xì)胞系,并利用MTT、Edu增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell等方法研究EZH2對(duì)NB細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和遷移的影響。結(jié)果:(1)成功建立穩(wěn)定過表達(dá)EZH2的NB細(xì)胞系SK-N-BE(2)-EZH2-COPGFP和降表達(dá)EZH2的NB細(xì)胞系SK-N-BE(2)-sh EZH2-74、SK-N-BE(2)-sh EZH2-77,并Western Blotting驗(yàn)證;(2)在SK-N-BE(2)細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)EZH2后,細(xì)胞增殖能力和遷移能力均較對(duì)照和空白組增強(qiáng);(3)在SK-N-BE(2)細(xì)胞中利用小RNA干擾下調(diào)EZH2表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力和遷移能力均較對(duì)照和空白組明顯減弱。4.EZH2在NB誘導(dǎo)分化中的作用影響方法:利用反式維甲酸(Retinoic Acid,RA)和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromodeoxyuridine,Brdu)誘導(dǎo)NB細(xì)胞系分化后,研究EZH2對(duì)NB誘導(dǎo)分化的作用影響。結(jié)果:(1)經(jīng)RA誘導(dǎo)刺激后,SK-N-BE(2)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的神經(jīng)分化,神經(jīng)軸突絲明顯,相互交錯(cuò),胞體變小,細(xì)胞胞體之間聚集,囊泡分泌增多,呈神經(jīng)節(jié)樣生長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯變慢;(2)經(jīng)Brdu誘導(dǎo)刺激后,SK-N-BE(2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)未發(fā)生明顯變化,但扁平寬大細(xì)胞(類似基質(zhì)細(xì)胞)成份略增多,細(xì)胞生長(zhǎng)速度未見明顯差異;(3)經(jīng)RA刺激后,EZH2、CD133和Vimentin蛋白均明顯減少,而Brdu誘導(dǎo)后EZH2和Vimentin蛋白表達(dá)增多,而CD133蛋白變化不明顯。結(jié)論:1.EZH2在高分期、伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NB患兒組織中高表達(dá),與Ki-67表達(dá)成顯著正相關(guān)性,并與患兒預(yù)后負(fù)相關(guān),提示EZH2是NB的一個(gè)促癌因素;2.細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示,EZH2促進(jìn)SK-N-BE(2)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和遷移;3.RA和Brdu誘導(dǎo)刺激SK-N-BE(2)后,EZH2蛋白表達(dá)發(fā)生明顯變化,提示其可能參與NB的腫瘤干細(xì)胞維持和誘導(dǎo)分化。
【關(guān)鍵詞】：EZH2 神經(jīng)母細(xì)胞瘤 靶向治療 分化 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.4
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號(hào)說明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 對(duì)象和方法15-32
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料15-21
• 1.1.1 細(xì)胞系15
• 1.1.2 病理切片標(biāo)本及臨床資料收集15
• 1.1.3 質(zhì)粒15
• 1.1.4 常規(guī)試劑和耗材15-16
• 1.1.5 各實(shí)驗(yàn)所需主要抗體16
• 1.1.6 各實(shí)驗(yàn)所需主要試劑配制16-21
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器21
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)方法21-31
• 1.3.1 免疫組化和表達(dá)情況評(píng)分21-22
• 1.3.2 免疫組織化學(xué)染色評(píng)價(jià)方法22
• 1.3.3 質(zhì)粒構(gòu)建、提取及鑒定方法22-24
• 1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代24-25
• 1.3.5 細(xì)胞凍存25
• 1.3.6 細(xì)胞復(fù)蘇25-26
• 1.3.7 鈣法轉(zhuǎn)染制備慢病毒26
• 1.3.8 慢病毒感染細(xì)胞26-27
• 1.3.9 提取細(xì)胞全蛋白27
• 1.3.10 Western Blotting27-28
• 1.3.11 Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell assay）28-29
• 1.3.12 Edu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)29-30
• 1.3.13 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（MTT）實(shí)驗(yàn)30
• 1.3.14 RA和Brdu誘導(dǎo)刺激30-31
• 1.4.病例隨訪及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法31-32
• 1.4.1 病例隨訪31
• 1.4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法31-32
• 結(jié)果32-44
• 2.1 EZH2蛋白表達(dá)情況與NB臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系32-35
• 2.2 EZH2蛋白表達(dá)情況與NB臨床預(yù)后之間的關(guān)系35-37
• 2.3 EZH2過表達(dá)及shEZH2慢病毒質(zhì)粒的成功構(gòu)建37-38
• 2.4 穩(wěn)定過表達(dá)和降表達(dá)EZH2的NB細(xì)胞系(SK-N-BE(2)-EZH2-COPGFP、SK-N-BE(2)-shEZH2-74和SK-N-BE(2)-shEZH2-77)的成功建立38-39
• 2.5 穩(wěn)定過表達(dá)和降表達(dá)EZH2后對(duì)NB細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和遷移能力的影響39-41
• 2.6 反式維甲酸和Brdu誘導(dǎo)NB細(xì)胞分化后，，EZH2蛋白表達(dá)水平發(fā)生變化41-44
• 討論44-47
• 3.1 EZH2強(qiáng)表達(dá)是NB的促癌因素，有望成為未來NB的靶向位點(diǎn)44-45
• 3.2 EZH2可能參與NB的誘導(dǎo)分化調(diào)控45
• 3.3 EZH2可能參與NB腫瘤干細(xì)胞的干性維持45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明51-52
• 綜述 外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤分化及去分化的相關(guān)研究進(jìn)展52-65
• 綜述參考文獻(xiàn)59-65
• 致謝65-67
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷67

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  本文關(guān)鍵詞：EZH2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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