本文關(guān)鍵詞：S100A9過(guò)表達(dá)在急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60對(duì)化療藥物耐藥作用中的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分S100A9慢病毒載體的構(gòu)建以及慢病毒的包裝目的:構(gòu)建S100A9慢病毒載體并包裝慢病毒顆粒,為該基因在AML對(duì)化療藥物耐藥作用中的研究奠定基礎(chǔ)。方法:以正常人BMMC c DNA為模板,克隆出S100A9全長(zhǎng)c DNA并裝載入p MD19-T載體中后,挑選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆中的S100A9片段裝載入目的載體p LVX-IRES-puro中,篩選陽(yáng)性克隆后進(jìn)行PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定。利用磷酸鈣沉淀法,將過(guò)表達(dá)載體與病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,分別收集24 h和48 h的病毒上清。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞,western blot檢測(cè)細(xì)胞中S100A9的蛋白表達(dá)。結(jié)果:克隆出的S100A9片段與p MD19-T載體連接后的陽(yáng)性克隆,經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證條帶大小與目的條帶大小幾乎一致。挑選其中的五個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示插入片段的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中S100A9的m RNA序列100%匹配。將測(cè)序正確的克隆中的片段插入目的載體p LVX-IRES-puro中,陽(yáng)性菌落經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證均與欲克隆的S100A9片段大小和序列100%匹配。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與轉(zhuǎn)染了空載體細(xì)胞中S100A9的蛋白含量相比,轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)載體細(xì)胞中S100A9的蛋白表達(dá)量顯著增加。結(jié)論:成功構(gòu)建S100A9慢病毒載體,并且包裝出慢病毒顆粒。第二部分S100A9過(guò)表達(dá)可以引起急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60的選擇性耐藥目的:研究S100A9過(guò)表達(dá)是否可以引起AML細(xì)胞株HL-60對(duì)臨床常規(guī)化療藥物(柔紅霉素、依托泊苷、阿糖胞苷以及高三尖杉酯堿)的耐藥。方法:利用慢病毒顆粒感染細(xì)胞并用嘌呤霉素藥物篩選的方式,建立S100A9穩(wěn)定過(guò)表達(dá)AML細(xì)胞株HL-60/S100A9,以及空載體HL-60/p LVX對(duì)照細(xì)胞株。四種臨床常規(guī)化療藥物柔紅霉素、依托泊苷、阿糖胞苷以及高三尖杉酯堿以依次遞增的濃度分別處理這兩組細(xì)胞24 h后,使用CCK 8檢測(cè)細(xì)胞活性。對(duì)照細(xì)胞的四種化療藥物的IC50分別處理兩組細(xì)胞24 h后,使用凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。以IC25和IC50分別處理兩組細(xì)胞后,使用western blot檢測(cè)藥物處理前后細(xì)胞中c-PARP的蛋白表達(dá)量。結(jié)果:外源性S100A9整合進(jìn)入HL-60細(xì)胞的基因組DNA中,同時(shí)HL-60/S100A9細(xì)胞中S100A9在m RNA和蛋白水平都顯著增高。HL-60/S100A9細(xì)胞經(jīng)過(guò)柔紅霉素、依托泊苷和阿糖胞苷三種化療藥物處理后,細(xì)胞活性未受影響;但是高三尖杉酯堿顯著抑制了細(xì)胞活性,與對(duì)照細(xì)胞相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。柔紅霉素、依托泊苷和阿糖胞苷藥物處理兩組細(xì)胞后,HL-60/S100A9組的凋亡細(xì)胞比率顯著低于HL-60/p LVX組;然而高三尖杉酯堿處理后,兩組凋亡細(xì)胞比例沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣,HL-60/S100A9細(xì)胞中c-PARP蛋白在前三種藥物處理后沒(méi)有顯著的改變;但是在高三尖杉酯堿處理后,蛋白表達(dá)呈現(xiàn)正向劑量依賴(lài)性。結(jié)論:S100A9的高表達(dá)可以引起AML細(xì)胞株HL-60對(duì)臨床常規(guī)化療藥物柔紅霉素、依托泊苷和阿糖胞苷的顯著耐藥,從而預(yù)示AML疾病對(duì)治療效果反應(yīng)不良。S100A9過(guò)表達(dá)的AML細(xì)胞株HL-60對(duì)高三尖杉酯堿敏感。第三部分S100A9過(guò)表達(dá)急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60對(duì)Mcl-1抑制劑敏感目的:進(jìn)一步研究S100A9引起AML細(xì)胞株HL-60對(duì)臨床常規(guī)化療藥物耐藥的分子機(jī)制,并探索解決S100A9引發(fā)化療藥物耐藥的途徑。方法:對(duì)HL-60/p LVX和HL-60/S100A9兩組細(xì)胞分別進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序。對(duì)測(cè)序分析挑選出的候選基因進(jìn)行蛋白水平的驗(yàn)證。使用Mcl-1小分子抑制劑YM-155處理細(xì)胞后,分別用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性以及western blot檢測(cè)藥物處理前后Mcl-1的蛋白表達(dá)。結(jié)果:RNA-Seq結(jié)果顯示,S100A9和Mcl-1的表達(dá)量在HL-60/S100A9中顯著增高。以HL-60/p LVX為對(duì)照細(xì)胞,抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2在HL-60/S100A9中表達(dá)量顯著增高。經(jīng)過(guò)四種化療藥物(DNR、VP-16、Ara-C和HHT)處理后,Bcl-2的蛋白表達(dá)量在兩組細(xì)胞中均未發(fā)生改變。經(jīng)過(guò)DNR、VP-16和Ara-C三種藥物處理后,Mcl-1的蛋白表達(dá)量在兩組細(xì)胞中也未發(fā)生改變;然而經(jīng)過(guò)HHT處理后,Mcl-1的表達(dá)量在兩組細(xì)胞中均顯著降低。Mcl-1小分子抑制劑YM-155分別處理兩組細(xì)胞后,細(xì)胞活性均受到抑制。并且,Mcl-1的蛋白表達(dá)量在兩組細(xì)胞中也隨著藥物處理濃度的增加而顯著降低。結(jié)論:S100A9過(guò)表達(dá)可以引起抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)量顯著上調(diào);并且使用Mcl-1抑制劑YM-155有望克服S100A9過(guò)表達(dá)引起的AML細(xì)胞株HL-60對(duì)化療藥物耐藥性。
【關(guān)鍵詞】：S100A9 慢病毒 p LVX 293T細(xì)胞 S100A9 HL-60 化療藥物 耐藥 S100A9 Mcl-1 化療藥物 YM-155
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R733.71
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 第一部分 S100A9慢病毒載體的構(gòu)建以及慢病毒的包裝12-24
• 引言12-13
• 材料與方法13-19
• 一、材料13-16
• 二、方法16-19
• 結(jié)果19-22
• 討論22
• 結(jié)論22
• 參考文獻(xiàn)22-24
• 第二部分 S100A9過(guò)表達(dá)可以引起急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60 的選擇性耐藥24-44
• 引言24-25
• 材料與方法25-34
• 一、材料25-30
• 二、方法30-34
• 結(jié)果34-38
• 討論38-40
• 結(jié)論40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 第三部分 S100A9過(guò)表達(dá)急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60 對(duì)Mcl-1 抑制劑敏感44-55
• 引言44-45
• 材料與方法45-47
• 一、材料45-46
• 二、方法46-47
• 結(jié)果47-49
• 討論49-51
• 結(jié)論51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 綜述 S100A9作為藥物靶點(diǎn)在腫瘤疾病中的研究55-68
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 英漢雙解縮列詞表68-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文69-70
• 致謝70-71

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