本文關(guān)鍵詞：靶向微管雙吲哚類化合物的篩選及HD-ZWM-288抗腫瘤多藥耐藥的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,全球新發(fā)癌癥病例及死亡人數(shù)逐年上升。由于微管在有絲分裂事件中的作用,其已經(jīng)是醫(yī)學(xué)上經(jīng)過驗證的化療藥物的靶點。我們首先對基于微管靶點的化合物進(jìn)行篩選,所采用的雙吲哚類化合物是在從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)的具有良好抗癌生物活性的新吲哚咔巴唑生物堿的基礎(chǔ)上,對已有的雙吲哚類化合物進(jìn)行修飾和改造得到的。在前期工作的基礎(chǔ)上,我們最終選用這十五個化合物進(jìn)行微管作用的篩選。我們對首先分析實驗中的十五個化合物對細(xì)胞周期的作用。結(jié)果顯示,大部分所選用的雙吲哚類化合物都有不同程度的周期阻滯作用。其中,在具有G2/M期阻滯作用的化合物中,HD-ZWM-288,HD-ZWM-597的作用最強。因此,我們推測HD-ZWM-288, HD-ZWM-597可能具有靶向微管的抗腫瘤活性。但由于HD-ZWM-597在體外實驗中毒性較大,HD-ZWM-288作為候選先導(dǎo)物進(jìn)行深入的體內(nèi)外靶向微管的抗腫瘤作用及其機制的研究。對HD-ZWM-288進(jìn)行計算機擬合分析,結(jié)果顯示HD-ZWM-288與靶點有非常好的對接。鑒于以上的實驗結(jié)果,我們推測HD-ZWM-288具有較好的靶向微管藥物的潛力,后續(xù)的試驗及機制的研究由李琳師姐完成,并且后續(xù)的研究表明,HD-ZWM-288確實具有良好的靶向微管的抗腫瘤的作用。但是,大多數(shù)微管抑制劑的副作用較大,并且使用過程中較易出現(xiàn)耐藥性。因此,急需開發(fā)活性更強、副作用較小,并且對多藥耐藥細(xì)胞也有效的新型微管抑制劑。在對化合物HD-ZWM-288的抗腫瘤的機制研究過程中,我們發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗多藥耐藥的作用。MTT實驗結(jié)果表明,相對于阿霉素和長春新堿,HD-ZWM-288對MDR細(xì)胞表現(xiàn)出有效的細(xì)胞毒性,尤其對K562/A02及K562這一組細(xì)胞作用最明顯。而對正常細(xì)胞具有較小的細(xì)胞毒性。不同濃度HD-ZWM-288作用的K562/A02及K562細(xì)胞12 h,在顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞膜皺縮,細(xì)胞裂解成碎片等形態(tài)變化。Annexin V/PI雙染法以及Western blot結(jié)果表明,HD-ZWM-288可以誘導(dǎo)K562/A02及K562細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。MDR的產(chǎn)生機制中最常見的是ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運蛋白家族過量表達(dá)誘發(fā)細(xì)胞外排作用增強。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果說明,在HD-ZWM-288可以誘導(dǎo)K562/A02及K562細(xì)胞內(nèi)的羅丹明的積累量呈濃度依賴性增加。Western Blot及實時定量PCR實驗說明HD-ZWM-288可以抑制P-gp的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平�；谶@些實驗結(jié)果,HD-ZWM-288是通過有效地抑制P-gp的作用,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)藥物的積累量,誘導(dǎo)耐藥腫瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡。影響P-gp表達(dá)的信號通路主要有ROS、MAPK、PI3K/AKT、及NF-κB信號通路。在本研究中,HD-ZWM-288可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平升高,線粒體膜電位下降,以及細(xì)胞色素C的釋放。這些試驗結(jié)果說明,HD-ZWM-288可能是通過ROS的產(chǎn)生來影響B(tài)cl-2和Bax的表達(dá),從而引起細(xì)胞凋亡。作為ROS的下游信號,MAPK與腫瘤的耐藥性息息相關(guān)。在本研究中,HD-ZWM-288可以顯著降低ERK/MAPK通路的表達(dá)水平,增加P38/MAPK通路的表達(dá)水平,增加了JNK/SAPK通路的表達(dá)水平。根據(jù)這些實驗結(jié)果,我們推測HD-ZWM-288的抑制耐藥細(xì)胞生長活性與其調(diào)節(jié)的這些蛋白激酶有關(guān)。MDR1啟動子區(qū)域存在著NF-κB的結(jié)合序列,NF-κB能夠激活連接MDR1啟動子的基因轉(zhuǎn)錄。AKT是NF-κB的上游信號,可以調(diào)控NF-κB的表達(dá)。在本研究中,HD-ZWM-288可以顯著抑制AKT的磷酸化,增加IκBα的表達(dá),進(jìn)而降低NF-κB的磷酸化。這些實驗結(jié)果表明,AKT/NF-κB信號通路也參與了HD-ZWM-288引起的P-gp的表達(dá)降低。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)HD-ZWM-288在細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡之前可以引起明顯的G2/M期阻滯。為了驗證ROS是否參與HD-ZWM-288引起的細(xì)胞周期阻滯,我們用ROS清除劑NAC提前處理細(xì)胞。結(jié)果顯示,在NAC的作用下,可以逆轉(zhuǎn)HD-ZWM-288引起的G2/M期阻滯。以上這些實驗結(jié)果說明,ROS是也參與HD-ZWM-288引起的細(xì)胞周期阻滯。綜上所述,HD-ZWM-288具有較好的抗腫瘤多藥耐藥作用。在HD-ZWM-288的作用下,細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,一方面降低Bcl-2的表達(dá),激活Bax蛋白家族,從而使線粒體膜電位下降,線粒體膜破裂,細(xì)胞色素C釋放,進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。另一方面通過作用于MAPK和AKT/NF-κB信號通路,抑制P-gp的表達(dá),進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)藥物積累量,引起細(xì)胞凋亡。同時HD-ZWM-288在引起細(xì)胞凋亡之前還會引起G2/M期阻滯,ROS也參與了這一過程。以上結(jié)果表明,HD-ZWM-288是一個具有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤多藥耐藥先到化合物,我們的研究也為其今后的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：微管 HD-ZWM-288 抗多藥耐藥 ROS MAPK AKT/NF-κB
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 縮略語詞匯表16-18
• 第一章 緒論18-26
• 1.1 腫瘤的化學(xué)治療與多藥耐藥18
• 1.2 多藥耐藥產(chǎn)生機制18-19
• 1.3 P-gp概述19-20
• 1.4 微管20-22
• 1.4.1 微管蛋白的結(jié)構(gòu)與功能20-21
• 1.4.2 靶向微管的藥物21-22
• 1.4.3 微管與細(xì)胞周期22
• 1.5 ROS的產(chǎn)生與細(xì)胞凋亡22-23
• 1.6 ROS-MAPK信號通路與多藥耐藥23-24
• 1.7 AKT/NF-κB信號通路與多藥耐藥24-26
• 第二章 靶向微管雙吲哚類化合物的篩選26-32
• 2.1 實驗材料26
• 2.1.1 細(xì)胞株26
• 2.1.2 化合物26
• 2.1.3 實驗試劑及配置26
• 2.1.4 實驗儀器及設(shè)備26
• 2.2 實驗方法26-27
• 2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)26-27
• 2.2.2 細(xì)胞周期檢測27
• 2.3 實驗結(jié)果27-30
• 2.3.1 雙吲哚類化合物對MDA-MB-231細(xì)胞周期的作用27-29
• 2.3.2 計算機靶點對接試驗29-30
• 2.4 討論30-32
• 第三章 HD-ZWM-288抗腫瘤多藥耐藥活性的研究32-61
• 3.1 實驗材料32-34
• 3.1.1 細(xì)胞株32
• 3.1.2 化合物32
• 3.1.3 實驗試劑及配置32-34
• 3.1.4 實驗儀器及設(shè)備34
• 3.2 實驗方法34-40
• 3.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)34
• 3.2.2 細(xì)胞周期檢測34
• 3.2.3 MTT法檢測細(xì)胞毒性34-35
• 3.2.4 Annexin V-PI雙染檢測細(xì)胞凋亡35
• 3.2.5 細(xì)胞總蛋白提取35
• 3.2.6 亞細(xì)胞蛋白分離提取35-36
• 3.2.7 蛋白定量36
• 3.2.8 Western Blot36-38
• 3.2.9 活性氧檢測38
• 3.2.10 線粒體膜電勢的檢測38
• 3.2.11 RNA的提取與Real-time PCR38-40
• 3.2.12 P-gp測定40
• 3.2.13 羅丹明123積累40
• 3.3 實驗結(jié)果40-58
• 3.3.1 多藥耐藥細(xì)胞株耐藥性的確定40-41
• 3.3.2 HD-ZWM-288體外抗腫瘤多藥耐藥活性檢測41-43
• 3.3.3 HD-ZWM-288誘導(dǎo)耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡的作用43-45
• 3.3.4 HD-ZWM-288對P-gp作用的實驗研究45-47
• 3.3.5 HD-ZWM-288誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS升高47-48
• 3.3.6 HD-ZWM-288誘導(dǎo)線粒體膜電位下降及細(xì)胞色素C的釋放48-50
• 3.3.7 HD-ZWM-288上調(diào)Bax/Bcl-2比例50-51
• 3.3.8 HD-ZWM-288抗多藥耐藥分子機制51-53
• 3.3.9 HD-ZWM-288對耐藥細(xì)胞周期的影響53-58
• 3.4 討論58-61
• 總結(jié)與展望61-62
• 參考文獻(xiàn)62-70
• 致謝70-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文71-72
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表72

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  本文關(guān)鍵詞：靶向微管雙吲哚類化合物的篩選及HD-ZWM-288抗腫瘤多藥耐藥的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：437030